[发明专利]一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，特别涉及一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法，该方法将菊花的茎段外植体培养成为无菌苗后，再取叶盘外植体于诱导培养基，进行体细胞胚诱导培养，得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。 

背景技术

菊花是中国的传统名花之一，在中国已有两千多年的栽培历史；同时也是世界重要的四大鲜切花之一。切花菊 ‘神马’（Chrysanthemum morifolium Tzvel.）是1987年在日本静冈县滨松市特种园艺所培育成功的白色秋菊品种, 从每年10月到次年5月一直在日本白菊市场上占有主导地位（邱美欢等，2008）。‘神马’的再生频率比较低，徐清燏(2005)用‘神马’叶片做外植体，不定芽诱导率为18.5%。孙庆春(2009)研究‘神马’叶片再生频率达到61.7%，再生频率依然不高。

植物体细胞胚发生是植物界存在的一种普遍现象。植物体细胞胚发生（somatic embryogenesis）是指体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的形态发生过程。经体细胞胚发生过程形成的类似合子胚的结构称为胚状体或体细胞胚。近年来关于观赏花的体细胞胚的研究比较多，在牡丹（周仁超等2001；周秀梅等2008；Bouza等1994)，月季(郭丽娟等2007；Dohm等2001；Kim等2003)，仙客来(卞福花2008；Takejiro等1995；Traud等2005)，梅花(宁国贵等2010；Cheong等2004；Tanaka等2000)，地被菊(蒋细旺等2007；蒋细旺等2008)等花卉品种已有报道。但是，国内外文献中尚无关于切花菊‘神马’体细胞胚的研究的报道。高效 ‘神马’体细胞胚再生技术的建立是通过转基因技术改良‘神马’花卉品质的基础。  

中国专利申请《一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法》（申请号：201010267217.0，公开号：CN101983555A）公开了一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法，该方法包括从外植体中诱导出胚性愈伤组织，再将其连续转接到两种不同的培养基中诱导体细胞胚的间接分化，得到菊花稳定的再生植株；该方法应用的菊花品种为“玉人面”、“铺地金”、“紫研”。该方法采用两种不同的培养基诱导体细胞胚的间接分化，步骤较繁琐，体细胞胚再生效率有限，且容易影响再生植株的遗传稳定性；该方法的胚性愈伤组织分化培养基中添加有价格昂贵的激动素（KT），配制培养基的成本高，不利于开展大规模的组织培养工作。

所以，在改良花卉品质的科研工作中需要一种直接诱导体细胞胚生长的、提高体细胞胚再生效率、成本低廉的“神马”菊花组织培养方法。

发明内容

本发明提供一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法，该方法将菊花的茎段外植体培养成为无菌苗后，再取叶盘外植体于诱导培养基，进行体细胞胚诱导培养，得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法，该培养方法包括以下步骤：

Ⅰ、消毒处理： 

A、选取菊花的茎段外植体，进行表面消毒处理；该表面消毒处理为：先将所述的茎段外植体用自来水冲洗，再放入吐温溶液中浸泡，得到表面消毒的茎段外植体；

B、将所述的表面消毒的茎段外植体转入超净台中，用酒精溶液浸泡，再用NaClO溶液浸泡，最后用灭菌的蒸馏水冲洗，得到灭菌后的茎段外植体；

Ⅱ、无菌苗培养：

将所述的灭菌后的茎段外植体转入生根培养基，进行无菌苗培养，得到无菌苗；

Ⅲ、体细胞胚诱导培养：

将所述的无菌苗的叶片剪成叶盘外植体，转入诱导培养基，进行体细胞胚诱导培养，得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。

优选地，步骤Ⅱ中，所述的生根培养基是以MS基本培养基成分中的大量元素减为原来的1/2、其他成分不变，得到的1/2MS培养基为基础，添加α-萘乙酸 （NAA）0.1mg/L；

优选地，步骤Ⅲ中，所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础，添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）3mg/L，6-苄基腺嘌呤（6-BA）2-3.5mg/L。

优选地，步骤Ⅲ中，所述的体细胞胚诱导培养中，先进行暗培养，再进行光照培养；所述的暗培养的时间为8-12天。

优选地，步骤Ⅲ中，所述的体细胞胚诱导培养的温度为25°C，光/暗周期为16h/8h，光照强度为2000-2500lx。