[发明专利]一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液及染色方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种考马斯亮蓝快速染色液及染色方法和应用，具体涉及一种SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)考马斯亮蓝R250快速染色液及染色方法和应用。

背景技术

蛋白质组学研究能够通过构建细胞中蛋白质表达的时间及空间差异图谱揭示生命规律。蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术是蛋白质组学研究的关键技术，而对凝胶的染色是得到可分析图谱的核心技术。在蛋白分析和检测上，考马斯亮蓝染色、硝酸银染色和荧光染料染色是广泛使用在蛋白分析和检测上的三种染色方法。硝酸银染色方法是公认的灵敏度较高的凝胶染色方法，灵敏度可达纳克级水平，但因其步骤繁琐延长实验操作时间增加样品污染的可能性，较高的凝胶背景导致最终结果差异较大重复性低，同时染色试剂中的戊二醛和甲醛对蛋白质的修饰作用导致染色后的凝胶对质谱的兼容性低。近年来，染色技术的发展荧光染料的研制成功使得荧光染色方法以其高灵敏度、可重复性及很好的质谱兼容性而备受瞩目。但由于荧光染料的昂贵价格，所需高端硬件及软件设备，另众多研究人员望而却步。

考马斯亮蓝(CBB)染色方法以较高重复性、较低凝胶背景、较高灵敏度及较高的质谱兼容性被广泛应用在蛋白质组学研究中，广泛采用的染料有考马斯亮蓝G250(CBBG250)和考马斯亮蓝R250(CBB R250)，能够检测到微克级水平的蛋白质。近年来本申请发明人所在实验室改进了传统的CBB染色方法，提高染色灵敏度，能够检测到纳克级的牛血清蛋白质条带，同时具有较高分辨率及较低背景。但是，染色前固定和敏化步骤繁琐，延长了操作时间，增加了样品被污染概率。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液，该染色液不需要染色前的固定和敏化步骤，能够缩短蛋白质染色时间，极大的减少了蛋白质样品被污染的可能性。

本发明的第二个目的在于提供一种利用上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法，该方法能够在极短的时间内完成染色步骤，并在短时间内得到低背景、高灵敏度、高分辨率的凝胶图谱，且质谱兼容性高。

本发明的最后一个目的在于提供上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液在蛋白质双向凝胶电泳以及蛋白质western blot定性和/或定量过程中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液，含以下含量的组分：体积百分含量为20～40％的乙醇，体积百分含量为5～10％的甲醇，质量浓度为0.5～1.25g/L的CBB R250，体积百分含量为2.5～5％的磷酸，质量浓度为100～200g/L的硫酸铵。

上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液，优选含有含以下含量的组分：体积百分含量为25～35％的乙醇，体积百分含量为6～9％的甲醇，质量浓度为0.8～1.0g/L的CBB R250，体积百分含量为3.2～4.2％的磷酸，质量浓度为125～175g/L的硫酸铵。

上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液，最佳含有以下含量的组分：体积百分含量为30％的乙醇，体积百分含量为8％的甲醇，质量浓度为0.85g/L的CBB R250，体积百分含量为3.5％的磷酸，质量浓度为150g/L的硫酸铵。

其中上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液可以通过如下方法配制获得：首先按上述计量比，将CBB R250粉末溶于乙醇、甲醇以及适量水的混合溶剂中，混匀后密封，于30～40℃环境中50～150转/分钟的条件下过夜，使各原料充分溶解，得染色液1；接着按计量比取硫酸铵溶解于适量纯水中，并加入磷酸，混匀后，得染色液2，将等体积的染色液1与染色液2混匀后，即制备得本发明所述的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：利用上述SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液进行染色的方法，含有以下步骤：将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液中进行染色，染色结束后取出SDS-PAGE凝胶，并将其置于脱色液中脱色。

具体步骤包括：将染色液在水浴中加热至染液温度均匀，将凝胶置于热的染液中染色一段时间，染色结束后取出凝胶，置于脱色液中摇床上轻摇一段时间后，取出凝胶在超纯水中浸泡至背景干净即可。

本发明将SDS-PAGE凝胶置于水浴加热的SDS-PAGE考马斯亮蓝R250快速染色液中进行染色的时间为4～8min，最佳为4min。