[发明专利]一种诱导人脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过含有粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），肿瘤坏死因子α（TNF-α），干细胞因子（SCF）和FMS样酪氨酸酶3配体（Flt3L）的培养基中培养脐血CD34+细胞，使它们分化朗格罕斯细胞的体外诱导方法，并且由此产生的朗格罕斯细胞具有纯度高、产量大的特点，并具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动免疫应答的功能。

背景技术

干细胞具有在培养基中无限分裂的能力，并且在特异性的分化刺激的刺激下产生构成组织的特化细胞。根据它们的分化潜能，干细胞分为胚胎干细胞（ES细胞）和组织特异性干细胞。

ES细胞是在胚泡期从胚胎内细胞团（ICM）分离而来，并且是多潜能的，即它们实际上能够分化为在生物体中发现的全部类型的细胞。相反，组织特异性干细胞在胚胎发育过程中器官形成的阶段出现，并且它们是器官特异性的和多功能的，即它们通常定向产生构成特定器官的细胞。这些组织特异性干细胞在大多数成年人器官中保留并履行不断补充正常或病理性发生的细胞损失的关键任务。代表性的组织特异性干细胞包括在骨髓中存在的造血干细胞和间充质干细胞。造血干细胞产生各种血细胞如红细胞和白细胞；间充质干细胞产生结缔组织细胞，例如成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞。

几年来，由于人胚胎干细胞的成功分离，干细胞的临床应用已经吸引越来越多的兴趣。干细胞最值得注意的潜在应用是它们作为细胞替代治疗的细胞供应的理想来源。

本发明的发明者发现能够使脐血CD34+细胞分化成高纯度及高产量的朗格罕斯细胞的物质，并且发现GM-CSF、TNE-α、SCF和Flt3L联合应用可诱导脐血单核细胞成为具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动机体免疫应答的朗格罕斯细胞。

目前尚未报道通过在含有GM-CSF、TNE-α、SCF和Flt3L的培养基中培养它们，能够使脐血CD34+细胞分化为高纯度、高产量及具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动免疫应答功能的朗格罕斯细胞。具体应用于在制备具有识别、摄取、加工和处理抗原及启动免疫应答功能的生物材料；所制备的生物材料将作为人造皮肤或皮肤移植中的辅助材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种使脐血CD34+细胞分化为高纯度、高产量及具有识别、摄取、加工和处理抗原的能力，启动机体免疫应答功能的朗格罕斯细胞的方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：一种诱导人脐血CD34+细胞分化为朗格罕斯细胞的体外培养方法，其步骤如下：

1）首先从人的脐血中分离出人脐血单个核细胞，然后对单个核细胞进行磁珠分选，得到CD34+细胞。

2）在添加粒-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α、干细胞因子和FMS样酪氨酸激酶3配体的RPMI1640培养基中培养所述CD34+细胞。

3）将所述培养基在37℃，5%CO₂条件下，培养至少6天，每2～3天更换一次培养液，获得朗格罕斯细胞。

上述的朗格罕斯细胞能够在制备具有识别、摄取、加工和处理抗原及启动免疫应答功能的生物材料中的应用。所述生物材料可以为人造皮肤或皮肤移植中的辅助材料

在本发明中，GM-CSF是维持朗格罕斯细胞发育及分化的最根本的细胞因子；TNF-α则抑制培养细胞向巨噬细胞分化，并维持朗格罕斯细胞于未成熟状态，使其具有强的抗原提呈作用；实验证明：GM-CSF和TNF-α联合应用可诱导脐血单个核细胞成为具有未成熟表型的朗格罕斯细胞。如果在相同但缺少GM-CSF和TNF-α情况下，细胞不能分化为朗格罕斯细胞。另外如果只用GM-CSF和TNF-α处理它们，则其增殖受到抑制。SCF和Flt3L加入含有GM-CSF和TNF-α的培养基中，则可见显著地增加朗格罕斯细胞的扩增数量和增大朗格罕斯细胞的集落。该结果提示在培养脐血CD34+细胞以获得朗格罕斯细胞的本发明的方法中，GM-CSF和TNF-α刺激干细胞分化为朗格罕斯细胞，SCF和Flt3L刺激细胞增殖。另外，当只使用所述因子的一种时不能获得充足的朗格罕斯细胞。

附图说明

图1为在含有200U/mL GM-GSF、50U/mL TNF-α、1U/mL SCF和5U/mL Flt3L的培养基中培养6天的朗格罕斯细胞的贴壁细胞的显微照片(×100)；

图2为在含有200U/mL GM-GSF、50U/mL TNF-α、1U/mL SCF和5U/mL Flt3L的培养基中培养12天的朗格罕斯细胞的贴壁细胞的显微照片(×100)；