[发明专利]玉米愈伤组织特异性启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物启动子及其应用，特别涉及一种玉米愈伤组织特异性启动子的克隆、功能验证与分析及其在培育安全性转基因植物中的应用。

背景技术

不同类型的细胞内所含的遗传信息虽然是相同，但是它们表达的蛋白却千差万别，这是由于不同基因差异表达的结果，而控制这些基因在不同的时空中进行表达的最主要的元件就是启动子。所谓启动子，它是位于转录起始点5’端上游，能够正确指导RNA聚合酶II同模板结合的一段DNA序列。对启动子序列研究发现，它的基本结构特征：位于转录起点上游富含一段AT碱基的TATA-box，决定转录的正确起始，真核生物的TATA-box一般位于帽位点的上游-20~-30bp区域；位于帽位点-80~~bp220区域，称为启动子上游顺时作用元件，决定基因转录的效率，如CCAAT-box和GC-box，这些上游元件在启动子中有时同时存在，有时单独存在，有的是多拷贝，有的是单拷贝，这些差异性的存在，决定了基因的时空差异性表达。

启动子根据其基因表达方式的不同分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。外源基因在时间和空间上的表达是持续性的，基因工程中常使用高活性的组成型启动子驱使外源性启动子在植物中表达，因其具有RNA和蛋白质表达量恒定性，无时空特异性，不受外界环境因素的诱导等特点，但这种表达往往会导致细胞内代谢产物的积累，增加细胞负担和造成能量浪费。而组织特异性启动子它可以驱使外源基因在植物特定时间、特定组织表达，按照人们的意愿改进植物代谢途径，使目的基因的表达产物集中、并且增加表达量。

玉米作为世界上最大的粮食和饲料作物，种子中贮存着丰富的蛋白质、淀粉和脂肪，是人类和动物食用植物蛋白的来源；在基因工程中可用作生物反应器, 在医疗和工业领域中也具有重要研究价值。本发明通过分子生物学的方法，从玉米B73自交系中克隆一段启动子序列与GUS基因融合后，导入水稻“中华11”中验证该段启动子的功能，为玉米在基因工程中的研究提供重要的调控元件，不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种启动子在玉米愈伤组织特异性表达。本发明所提供的玉米愈伤组织特异性启动子片段，命名为LEG，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）B73自交系，该启动子片段大小为1910bp。

本发明所涉及的设计方案为一种玉米愈伤组织特异性启动子，具有序列表中SED ID NO:1项下的序列。通过玉米B73提取总DNA克隆获得的LEG基因启动子序列，经测序其长度为1910bp，同NCBI报道的序列比对完全一致；通过启动子软件分析，该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件。

本发明还提供了一种愈伤特异性表达的载体，其特征在于转入了前述的玉米愈伤特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米特异性启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCAM–pLEG。通过农杆菌介导法转化水稻，成功获得转基因植株。PCR和Souther杂交结果表明玉米特异性启动子整合到水稻基因组中；GUS组织化学染色鉴定证实LEG基因的启动子为愈伤特异性表达启动子，pCAM–pLEG为一种愈伤特异性表达的载体。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种玉米愈伤组织特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

在另一个实施方案中，本发明提供了所述启动子用于在植物愈伤组织中特异性表达目的基因的用途。

在其他实施方案中，本发明提供了包含所述玉米愈伤组织特异性启动子的植物表达载体。在一个实施方案中，所述载体是用所述玉米愈伤组织特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。在另一实施方案中，所述植物表达载体能调控目的基因在植物愈伤组织中特异性表达。

在其他实施方案中，本发明还提供了所述启动子用于构建在植物愈伤组织中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。

有益效果