[发明专利]东方百合种球脱毒方法

权利要求书

1.东方百合种球脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20～40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45～55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中，每箱下种20～25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持基质45～55%的水分；在温度为21～23℃，湿度为70～80%，光照强度1500～2000Lx，光照时间8～12h/d的条件下，经过5～7天后，芽长到5～6cm时进行热处理脱毒；

B、热处理脱毒：将温度控制在35～38℃之间，湿度为70～85%，光照强度1500Lx，光照时间8～12h/d的环境条件下，经过7～15天培养，芽长高并绽开成莲座状；

C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8～15秒；④ 吐温80无菌水浸泡2～3分钟；⑤再用无菌水洗5～7遍至无泡沫；

D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3～0.5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21～23℃，光照强度1500～3000Lx，光照时间8～12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2～3cm的叶丛；

E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21～23℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～3000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗；

F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。

3.根据权利要求1所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3～0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。

4.根据权利要求2所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3～0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D中的诱导培养基为： 1／2MS+BA2.5～5mg/L+ NAA0.25 mg/L+糖40g/l+琼脂 5.5g/L。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

7.根据权利要求5所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 病毒唑5 mg/L+ 琼脂6.0 g/L。

8.根据权利要求6所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，

步骤E中病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至35～40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。

9.根据权利要求7所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，

步骤E中病毒唑的添加方法如下： 

a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；

b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；

c.将高温灭菌后的培养基：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖 + 活性炭0.5%+ 琼脂6.0 g/L，冷至35～40℃时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。