[发明专利]人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明公开一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，涉及在大肠杆菌中高效可溶性表达人LOX-1细胞外结构域 (hLOX-1 ECD) 的表达载体的构建、高效可溶性表达条件的确立及规模化大量纯化工艺的建立，可用于hLOX-1 ECD的大量制备，属生物工程技术领域。

背景技术

心脑血管疾病的前身是动脉粥样硬化(Arteriosclerosis, 以下简称As)。As是经多年无症状发展而突然致残致死的疾病，70％-80％的冠状动脉血栓的形成是继发于As斑块的破裂。对人类而言，随年龄的增长动脉硬化几乎是不可避免的。As在形成脂纹这种初级阶段的时候是可逆的，经治疗，内腔狭窄和斑块可以回缩。所以As的早期诊断和及早针对性治疗对防治心脑血管疾病具有重要的现实意义。

在As的发生机制研究中，人们发现氧化型低密度脂蛋白 (Oxidized Low Density Lipoprotein，以下简称ox-LDL) 是导致血管内皮细胞激活、损伤和功能失调的主要危险因子，在As的发病过程中起关键作用。植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1 (Lectin-like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor-1，以下简称 LOX-1) 是介导血管内皮细胞对ox-LDL摄取的主要受体。

从1997年Sawamura等在牛主动脉内皮细胞中发现了ox-LDL的受体LOX-1、次年Yamanaka等发现人主动脉内皮细胞中同样存在LOX-1以来，研究者们围绕着LOX-1与As间的关系进行了深入细致的研究。众多研究结果表明，LOX-1存在于As发生和发展的全过程中，是抗As药物筛选的新靶点和急性冠脉综合症的敏感而特异的生物标志物。然而，以LOX-1为靶点的药物筛选和诊断试剂的研制工作，却由于无法获得大量可溶且稳定的LOX-1蛋白而始终无法顺利进行。 

到目前为止所报道的LOX-1在大肠杆菌中的表达均是以包涵体形式存在的，包涵体复性是获得重组蛋白的主要方法。在众多的包涵体复性方法中，只有Machida等开发利用人工分子伴侣新材料对包涵体进行复性的方法 [日本专利，公开号：P2001-261697A]被商业化。Xie等利用该方法成功地获得了LOX-1 C-末端凝集素样结构域(CTLD)的活性蛋白，Ohki等在此工作基础上得到其结晶体及X线的立体结构数据。然而包涵体复性因存在如下不足：①反应条件苛刻，需要蛋白变性剂的参与；②过程复杂，费时且效率低；③回收率低，易造成大量损失；④复性后蛋白的稳定性差，在实际应用中受到制约。在大肠杆菌中可溶性表达LOX-1尚未见报道。

发明内容

本发明提供一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，其目的是获得大量可溶且稳定的hLOX-1 ECD蛋白。

本发明公开的人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，其技术解决方案包括以下步骤：

（1）表达载体的构建

表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其pI值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒。

（2）表达条件的优化

使用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度。

（3）hLOX-1 ECD蛋白的纯化

利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 ECD蛋白。

实现上述方法的具体步骤如下：

1、表达载体的构建

选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人LOX-1 cDNA中扩增hLOX-1 ECD基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；

1）以人LOX-1 cDNA作为模板，设计引物：

引物1：5’-caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’

引物2：5’-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3’

进行PCR反应，扩增出hLOX-1 ECD基因片段；