[发明专利]抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法。

背景技术

抗毒素、抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体（IgG）或抗体片段[F(ab’)₂]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。

由于抗毒素、抗血清原料来源于马匹血浆，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除了要控制免疫马匹的饲养环境和马匹血浆质量外，在抗毒素、抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的关键问题。

目前国内外较为成熟的病毒灭活、去除方法有：巴氏消毒法、干热法、有机溶剂及去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产抗毒素、抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。

有机溶剂及去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。参照欧洲药品管理局（EMEA）和我国国家食品药品监督管理局发布的，针对人血液制品的相关技术法规，需要在抗毒素、抗血清生产工艺中增加有机溶剂及去污剂处理灭活病毒的步骤，其中有机溶剂选用磷酸三丁酯，去污剂选用Triton X-100。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微。但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。因此，经有机溶剂及去污剂（磷酸三丁酯/ Triton X-100）灭活的抗毒素、抗血清制品中Triton X-100的残留量测定，是涉及其质量控制的关键指标之一。

由于目前在抗毒素、抗血清制品中并无Triton X-100残留测定的通用方法，因而难于有效控制经有机溶剂及去污剂灭活病毒的抗毒素、抗血清制品的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种经有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量，并且方法准简便、快速。

本发明通过下列技术方案实现：一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液、供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗毒素/抗血清中Triton X-100的残留量，其特征在于所述对照品溶液与供试品溶液的制备经过下列各步骤：

（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL溶液中含有5～20μg的Triton X-100的对照品溶液；

（2）取供试品抗毒素、抗血清0.5～1mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，后用体积浓度为5～10%的甲醇溶液清洗，再用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液。

所述采用高效液相色谱法进行测定的色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水溶液为流动相，并采用紫外检测器，其检测波长为220～240nm。

所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9︰1～7︰3。

所述步骤（2）中固相萃取柱的活化是：先用1mL的甲醇通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱，即得活化的固相萃取柱。

所述甲醇为市购的分析纯产品。

所述步骤（2）中的固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱，为ProElut PLS、Oasis HLB、BOND ELUT PLEXA中的一种。

所述步骤（2）中的供试品抗毒素/抗血清是指经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清。

本发明能对破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的Triton X-100残留量进行测定。