[发明专利]实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及监测指示剂的制备方法及应用方法，具体涉及实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法。

背景技术

随着科技水平的不断进步，生物化学逐渐成为探索活体细胞合成代谢、分解代谢基本原理的主要手段，使人们能够了解各种酶的功能，并通过晶体学从原子层面揭示蛋白质的结构，为深入研究及有效利用打下基础。然而，生物化学中并未能提供一种实验工具，用以定量并在实验中从时间、空间上精确地监控分子水平的细胞内或细胞外生理病理变化，从而确定活体系统的动态行为。为获得这些认识，实验方面及概念上的新工具必不可少。如今，在20世纪60年代分离自维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白 （Green   fluorescent protein，GFP ）以及经改造获得的突变体构成的“GFP 家族”蛋白，使这样一种工具成为现实并得到飞速发展(Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol,1962（59）:223-239)。

荧光蛋白常用于基因转录或作为一种与目的基因结合的报告基因。荧光蛋白基因在N端或C端与异源基因接合够成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然荧光蛋白相似的荧光特性（Jones JJ, Bridges AM, Fosberry AP,et al.Potential of real-time measurement of GFP-fusion proteins. J Biotechnol,2004（109）:201–211）。荧光蛋白的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和定位，还用于细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程观察等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行分析研究（Chalfie M，Tu Y, Euskirchen G,et al。Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science,1994（263）:802-805.）。与传统抗体标记技术相比具有更高的灵敏度、简化细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤，可用荧光显微镜直接进行观察，而且荧光蛋白没有毒性，在不同的生物中都能高水平表达且不影响其生理机能。