[发明专利]一种测定汞离子含量的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗汞离子单克隆抗体的制备及一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于环境安全监督或食品分析的研究领域。

背景技术

汞是一种对人体健康危害极大的重金属元素。汞离子会沉积在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，甚至引起死亡。另外，汞元素及其化合物如甲基汞、乙基汞等能够通过皮肤被吸收，引起口腔炎、齿龈炎和神经紊乱等疾病。汞被优先列在全球环境监控系统(GEMS)清单上，世界各国都花费大量的人力、物力和财力在开发和研究新型的检测汞离子方法。

目前常用的检测汞离子的方法有原子吸收/发射光谱法、诱导等离子质谱法、原子荧光光谱法、阳极溶出伏安法等，这些方法虽然灵敏度较高，但仪器昂贵，操作复杂。

酶联免疫分析方法是一种建立在抗原与抗体之间特异性反应基础上的分析方法，具有灵敏度高、特异性强、简便、快速、可同时检测大量样品的特点，已广泛应用于临床、生物、食品和环境分析领域中。目前，酶联免疫分析方法也已用于食品和环境中重金属的检测。

建立检测重金属的酶联免疫分析方法的关键是制备出抗重金属离子的特异性抗体，而抗体的制备又取决于免疫原。由于重金属离子自身不能作为免疫原免疫动物，目前大多采用选择一种合适的螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和反式-环己基二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)等，使之与金属离子配位，再与大分子蛋白结合，从而制备出免疫原。但这些螯合物的空间结构较大，金属离子被包裹在其中。所产生的抗体能识别重金属螯合物形成的外壳，对重金属离子本身未必识别，因此抗体的特异性不够高；另外在检测样品时，必须先加入一定量的螯合剂，使之与待测重金属离子形成能被抗体识别的重金属螯合物，从即使测定过程变得更为复杂。

由于汞与巯基具有很强的结合能力，本专利选用了一种带有巯基和羧基的物质即6-巯基烟酸(MNA，分子结构见图1)作为配体，利用其上的羧基，将配体与载体蛋白连接，再利用其上的巯基与氯化甲基汞相连，生成的甲基汞-MNA-载体蛋白用作免疫原及包被抗原；运用杂交瘤抗体制备技术，经动物免疫、融合、筛选等步骤，制备出抗汞离子的单克隆抗体并对抗体各种性能作了鉴定，建立了测定汞离子的间接竞争酶联免疫分析法，并用于食品和环境样品中汞离子的检测。

发明内容

本发明的目的是制备抗汞离子的单克隆抗体，并建立一种测定食品和环境中汞离子含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。

一种测定汞离子含量的分析方法，包括以下步骤：

步骤一：免疫原和包被抗原的制备；

步骤二：汞离子单克隆抗体的制备；

步骤三：优化实验条件，建立测定汞离子的酶联免疫吸附分析方法；

步骤四：ELISA对加标样品中汞离子含量的测定。

其中，所述的步骤一包括：

取6-巯基烟酸MNA与等摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N，N’-二环己基碳二亚胺溶于N，N’-二甲基甲酰胺，反应过夜后离心，上清液缓慢加入40～80mg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA的碳酸氢钠溶液中，搅拌反应2～4小时后，离心，上清液用0.01mol/L PBS溶液透析，得到MNA-BSA或MNA-OVA混合液；然后将氯化甲基汞CH₃HgCl溶液缓慢滴入上述溶液，反应后混合液于0.01mol/L的(NH₄)₂CO₃溶液透析，冻干，于-4℃保存；其中CH₃Hg-MNA-BSA为免疫原，CH₃Hg-MNA-OVA为包被抗原。

其中，所述的步骤二包括：免疫、融合、筛选、单克隆抗体的生产。

其中，所述的步骤三包括：

(1)溶液配制；

(2)间接ELISA筛选单克隆抗体；

(3)间接竞争ELISA步骤；

(4)ELISA实验条件的优化；

(5)ELISA的标准曲线及灵敏度；

(6)ELISA的特异性。

其中，所述(1)溶液配制包括：

(1)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(2)磷酸盐缓冲液；

(3)酪蛋白溶液；

(4)磷酸缓冲液-吐温储备液；

(5)汞离子储备液；

(6)底物溶液；