[发明专利]一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用。

背景技术

鬼臼毒素是重要的芳基四氢萘内酯类木脂素，具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗免疫、抑菌杀虫、治疗牛皮癣、疟疾、类风湿性关节炎、多发性硬化、抑制植物生长、抗氧化等作用，是近年来合成抗癌药物VP-16(etoposide)和VM-26(teniposide)等的前体物质。VP-16和VM-26对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效，已开发成为抗癌药物应用于临床。

目前鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取，而这类植物在全世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区。野生鬼臼类植物生长缓慢，且其中鬼臼毒素类物质的含量较低。随着医学和农林防治方面对鬼臼毒素类物质需求量日益增加，随着对野生鬼臼类植物原料的采集的加剧，其资源遭到严重破坏，造成了生物多样性和生态环境的不可逆损失；由于鬼臼毒素类物质化学结构复杂，对其进行化学全合成的难度较大；基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。因此需要寻找有效可行的制备鬼臼毒素类物质的方法。

近年来，已有学者从鬼臼类植物(包括八角莲属、桃儿七属、足叶草(鬼臼)属和山荷叶属)中分离到产鬼臼毒素类似物内生真菌，其培养物经TLC检测和HPLC检测，与鬼臼毒素标准品有相同的Rf值和保留时间(川八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究，郭仕平、蒋斌等，生物技术，2004.14(2)：55-56；鬼臼类植物产鬼臼毒素内生菌的筛选，杨显志，郭仕平等，2003.15(5)：419-422；从南方山荷叶分离出一株产鬼臼毒素类似物的内生真菌，曾松荣，邵华等，微生物学杂志，2004，24(4)：1-2.)。因此，利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性质，可能是一种解决鬼臼毒素的来源问题的有效方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种镰孢(Fusarium sp.)TG-9。

本发明提供的镰孢(Fusarium sp.)TG-9，其保藏号为CGMCC No.5528。

上述镰孢(Fusarium sp.)TG-9 CGMCC No.5528在制备鬼臼毒素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备鬼臼毒素的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528，收集发酵产物，即得到鬼臼毒素。

上述方法中，所述发酵的温度为26℃-30℃，所述发酵的转速为100rpm-150rpm，所述发酵的旋转半径为2cm，所述发酵的时间为5天-9天。

上述方法中，所述发酵的温度具体为27℃，所述发酵的转速具体为120r/min，所述发酵的时间具体为8天。

上述发酵采用的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，是按照如下方法配制的：称取马铃薯200g(去皮、切成约2cm²的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至1000mL，自然pH。

上述方法中，在所述发酵后，还包括如下步骤：

1)将所述发酵产物抽滤，收集滤液；

2)将步骤1)得到的滤液加入氯仿萃取，收集有机相，得到鬼臼毒素。

上述方法中，所述滤液和所述氯仿的体积比为1∶1。

上述提到的菌株TG-9于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5528，其分类命名为镰孢(Fusarium sp.)。

本发明的实验证明，本发明提供了一株菌株，其可以用于制备鬼臼毒素。本发明的制备鬼臼毒素的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点，为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。

附图说明

图1为镰刀菌属真菌的菌落

图2为镰刀菌属真菌的菌丝体和孢子形态

图3为混标与样品TG-9提取物在HPLC-MS检测中HPLC图谱

图4为混标与样品TG-9提取物的EIC图谱