[发明专利]获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种从大肠杆菌中快速、经济、高效地获得克隆表达的可溶性斑马鱼肌酸激酶蛋白并验证的方法，为获得融合表达蛋白研究提供便利，具有广泛的科研价值和应用前景。

背景技术

肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是细菌的一种，由Escherich在1885年发现。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)(ATP：Creatine N-phosphotransferase EC 2.7.3.2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，可作为研究蛋白质折叠的理想模型。肌酸激酶是心肌梗塞和骨骼肌疾病等的临床诊断方面的一个重要指标。

斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼(Brachydanio rerio)，原产于印度、孟加拉国。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，其基因与人类87％相似，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。

目前，常用的破碎大肠杆菌获得目的蛋白的方法有超声破碎、玻璃珠破碎等机械法，干燥法、冻融法等物理法、化学试剂处理、酶解法等化学方法。

传统的冻融法是在-20℃以下，而且所适用于动物性材料，对微生物作用较差。传统的酶解法一个是浓度的问题，浓度一般为300μg/mL-1mg/ml，浓度太高，容易造成产物抑制作用；此外含量过高在镍柱纯化时候容易堵塞柱子，给进一步纯化带来困难。此外，溶菌酶的处理时间均需要1h以上，不同的菌种需选择不同的酶，不适宜大量方便快捷蛋白质提取。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、经济、高效地破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，采用该方法能有效获得高质量且含量高的总蛋白，包括目的蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，依次包括以下步骤：

1)、在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至IPTG的终浓度0.9～1.1mM；220rpm、36.5～37.5℃培养摇床振荡继续培养4.5～5.5小时；

所述菌液的OD_600nm为0.4～0.6；

OD是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，nanodrop仪器检测；

2)、将步骤1)的所得菌液先于11000g～13000g离心9～11min，弃上清，所得的沉淀中先加入PBS重悬，重悬后再加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为180～220μg/mL；

3)、先将上述步骤的所得物于36.5～37.5℃处理8～12min，然后于液氮中冰冻38～42秒；再于室温中自然解冻至液态；

4)、重复上述步骤3)2次；

5)、将步骤4)的所得物先于11000g～13000g离心9～11min，取上清，所述上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。

作为本发明的获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法的改进：

步骤1)为：在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液加入IPTG至IPTG的终浓度1mM；220rpm、37℃培养摇床振荡继续培养5小时；

步骤2)为：使溶菌酶的终浓度为200μg/mL；

步骤3)为：先将上述步骤的所得物于37℃处理10min，然后于液氮中冰冻40秒；再于室温中自然解冻至液态。

在步骤2)中，每1ml的步骤1)的所得菌液配用80～120μL的PBS(即PBS缓冲液)。