[发明专利]凝集素富集和18O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白组定量方法，具体涉及一种用于糖蛋白组学研究的凝集素富集和¹⁸O标记结合自定义算法的糖蛋白组定量方法，属于生物技术领域。

背景技术

蛋白的糖基化是重要的翻译后修饰，对于蛋白的折叠、稳定性和活性都有着重要的意义。蛋白的糖基化和糖型改变在慢性炎症、免疫应答、细胞识别及细胞免疫调控等病理生理过程中均起重要作用，且在恶性肿瘤的发生过程中参与细胞的恶性转化、提示病灶周围的微环境变化并与恶性肿瘤的发展侵袭紧密相关；很多已知的癌相关生物标志物(Biomarker)都是糖蛋白，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)等；这些都决定着糖蛋白组学在疾病及肿瘤研究中具有重要而独特的地位。

如何目的性的富集糖蛋白并进行有效识别和定量是目前糖蛋白组学研究中的主要难题。研究人员已建立很多富集技术用于N糖基化蛋白分析，但这些技术多集中于以下三种情况，1)研究糖基转移酶的改变或样品中糖蛋白/糖肽的总体糖基化程度和糖链结构改变趋势，但不能明确单个糖蛋白发生的具体糖链结构的改变情况；2)针对单独的蛋白进行糖链变化研究，如AFP异质体就是利用AFP蛋白N糖链上的α1-6岩藻糖的增加来进行诊断，但每次实验只能选择性的研究一种或数种蛋白在特定糖链类型上的水平改变；3)研究糖链结构在不同疾病状态下的整体改变情况，但无法将这些糖链结构改变和具体的蛋白结合起来，只能孤立的进行总体糖链改变的研究。这些方法均针对于样本中的总糖蛋白或总糖链进行研究，无法实现对组织或血液等复杂生物样本中大量复杂糖蛋白的糖基化改变的高通量定量研究，而复杂样本中每个糖蛋白的糖基化改变都会导致相应糖蛋白功能的改变，从而引起人体的病理变化过程，尤其是参与肿瘤的发生和侵袭转移过程。

¹⁸O标记是一种相对简单、特异和成本效益好的稳定同位素标记技术，它可以对样本中所有胰蛋白酶裂解的肽段C端羧酸进行普遍而序列独立性的标记，同时没有副反应的发生。研究者对其进行了不断的完善，Liu等富集总糖肽后在肽段C端及N糖基化位点序贯标记3个¹⁸O，与¹⁸O标记的糖肽产生6Da质量差，提高了糖基化位点鉴定和相对定量研究的准确性，得到较好的结果。但这种3¹⁸O的标记技术，没有成熟的计算机自动化处理算法和专用软件，只能依靠手工计算，这也是以往的开发者所特别指出的不足之处(Liu et a1.Proteome Res 9，227-236，2010)，对于大样本量的复杂生物样本的数据处理显然力不从心，同时这个方法尚无法确定发生糖基化改变的糖蛋白所发生的具体糖链结构变化。

本发明针对上述糖蛋白研究中富集、标记和计算等主要问题，建立了一个整体性的策略，应用凝集素层析富集不同糖链特征的蛋白样本，联合固化胰酶(Immobilized Trypsin)及N-糖酰胺酶(PNGase-F)进行序贯¹⁸O标记，将不同糖型的配对蛋白样本以液相色谱-质谱(LC-MS)进行相对定量，而且建立基于Mascot Distiller软件(版本2.3.2.0，Matrix Science公司)的自定义的自动化算法进行数据处理，最终能够全面研究复杂生物样本中的不同糖链结构类型的糖蛋白改变情况。本发明在标准糖蛋白中验证了此方法的准确性和可重复性，又以健康人和肝癌患者的血清以ConA(concanavalin A)、LCH(Lens culinaris)和WGA(Wheat Germ agglutintin)三种凝集素层析后进行标记，通过自建的算法获得了定量数据，并加以验证，显示了这种方法可以高通量的获取复杂样本中糖蛋白的糖型变化，改进层析和标记方法后，这种整体性的研究策略可以应用在更广泛的组织标本或体液标本中，有利于疾病生物标志物的发现和疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖蛋白组定量方法，用于在复杂的生物样本中，进行相对定量的高通量糖蛋白组学研究，寻找疾病相关糖基化位点，分析糖基化程度改变、糖链结构变化与病变的关系，寻找疾病相关的糖生物标志物，进行相关药理学和药效学研究，以真正了解糖蛋白的糖型对于疾病发生发展的意义。

为了达到上述目的，本发明提供了一种糖蛋白组定量方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将来自不同疾病或者相同疾病不同阶段患者的血清样本分为两组，(各组样本根据研究目的可以等量混合或不混合)，除去高丰度蛋白，测定蛋白浓度，取等蛋白量样本进行除盐和酶解；