[发明专利]一种巨尾桉转化方法

权利要求书

1.一种巨尾桉转化方法，包括以下步骤：

(1)将目的基因连入含有6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)的表达载体pCAMBIA1301上，将所述载体导入根癌农杆菌EHA105；

(2)将所述农杆菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培养基中，28℃，180转/分钟，避光摇至OD值为0.4～0.6；8000转/分钟，离心10分钟，沉淀收集菌体；

(3)使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2-(N-吗啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖1.8g/L的无蔗糖MS液体培养基悬浮菌体，悬浮后的菌液OD值仍调至0.4～0.7；

(4)取巨尾桉组培苗茎段，剪为0.5厘米左右，接种于预培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养1天，进行预培养；

(5)取悬浮后的菌液侵染经预培养的巨尾桉茎段，侵染时间为4～7分钟；侵染后接种至共培养愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养3天中，进行共培养；

(6)将共培养后的茎段转接至筛选阶段的愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃的培养室中，暗培养40～45天，进行选择性培养；

(7)统计选择性培养后的愈伤组织诱导率，将产生的愈伤组织接至筛选阶段的分化培养基中，在光照强度为1500～2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2℃的培养室内进行芽分化培养；

(8)约25～30天后，将分化得到的芽编号，并移入新的筛选阶段的分化培养基中继续进行分化培养；

(9)取分化培养中高约2厘米左右的小芽，接入筛选阶段的生根培养基中，在光照强度为1500～2000勒克斯、光周期为18小时/天、温度为25±2℃的培养室内进行生根培养，40～45天后将生根巨尾桉幼苗移入土中；

(10)取经筛选培养得到的巨尾桉株系叶片进行氯酚红检测，转化成功的株系的检测液产生变色反应；用转化成功的株系提取DNA，以AmCBL1基因正向引物AmCBL1-1和反向引物AmCBL1-2为引物，经PCR反应进行转基因鉴定，确定这些株系的DNA中是否获得了目的基因。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因来源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Cheng f.)，该基因由其特异性启动子AmCBL1P所驱动。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述悬浮后的菌液OD值仍调至0.5～0.6。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述侵染时间为5～6分钟。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述预培养愈伤诱导培养基是含苯基噻二唑脲(Thidiazuron，以下简称TDZ)0.5mg/L、萘乙酸(1-naphthlcetic acid，以下简称NAA)0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述共培养愈伤诱导培养基是含羧苄青霉素(Carbenicillin，以下简称Car)200mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7g/L的MS培养基。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述筛选阶段的愈伤诱导培养基是含有Car200mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的MS培养基。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述筛选阶段的分化培养基中是含有Car 200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的MS培养基。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述筛选阶段的生根培养基是含有Car 200mg/L、IBA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和琼脂7g/L的1/2MS培养基。