[发明专利]特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体

说明书

技术领域

本发明涉及特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体及用于诊断疟疾的组合物。

背景技术

疟疾的症状包括头痛、肌痛、发热、呕吐等等。然而，基于这些症状并不能诊断疟疾，因为它们并不是疟疾特有的症状。典型地，疟疾通过显微镜检查来诊断，但是，由于该方法需要昂贵的设备和熟练的操作人员，因此并不适用于疟疾流行地区的初步诊断。免疫层析诊断分析提供了潜在的替代方法。然而，基于抗原-抗体反应，典型免疫层析便携式诊断试剂盒可随其储存环境而在诊断准确度方面发生变化。在疟疾爆发的情形下根据初步诊断作出的初步应对措施对疟疾的后续治疗具有重大影响，因此，便携式诊断试剂盒必须具有良好的性能。

pLDH是一种必需酶，该必需酶是在疟疾寄生虫的整个生命周期中可检测的，并且该必需酶参与疟疾寄生虫的新陈代谢。全部四种疟疾寄生虫具有这种酶，所述酶具有高度保守的氨基酸序列。目前大多数可用的便携式疟疾诊断试剂盒均基于pLDH的抗体并且可用于诊断所有四种疟疾。

适体为一种结合于特异性标靶的单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。得益于适体对特异性标靶的高亲和性和高稳定性，最近它们被广泛地研制并活跃地应用于疾病的治疗以及诊断疾病的传感器中。适体的合成可相对容易，并且可使用细胞、蛋白甚至小的有机物质来作为它们的标靶，这使新的检测方法得以发展。此外，因为适体与先前研制的抗体相比具有更良好的特异性和稳定性，发现适体可在各种领域中广泛应用，包括治疗方法、药物递送系统、诊断用的生物传感器的研制等等。

为诊断用途而研制的抗体使用免疫系统来制备，因此它们具有制备时间相对长、成本相对高的缺点。此外，与适体、DNA或RNA相比，上述为诊断用途而研制的抗体是具有较低稳定性的蛋白，这可阻碍高度敏感的传感器的研制。由于大多数疟疾流行的地区是炎热且潮湿的，基于抗体的诊断系统显示出低准确性。

因此，需要一种可克服现有技术面临的问题的疟疾诊断系统。

发明内容

本发明提供特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体、包含所述DNA适体的用于诊断疟疾的组合物，以及使用所述DNA适体的疟疾诊断试剂盒。

然而，本发明将要实现的技术目标并非仅限于上面提及的目标，本领域技术人员可从下列给出的描述中清楚地理解其他目标。

本发明一方面提供特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的适体，所述特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的适体具有SEQ ID NO：1的碱基序列或SEQ ID NO：2的碱基序列。

本发明另一方面提供用于诊断疟疾的组合物，所述组合物包含特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体。

本发明又一方面提供用于疟疾的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒使用特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体。

本发明的一种实施方式中，本发明的DNA适体与SEQ ID NO：1的碱基序列或SEQ ID NO：2的碱基序列具有70％的序列同源性或高于70％的序列同源性。

由于在特异性和稳定性上比常规用于诊断疟疾的抗体更加优越，本发明的特异性结合于疟原虫乳酸脱氢酶pLDH的DNA适体可制成生物传感器，所述生物传感器以高敏感度和高准确度测定pLDH水平，这大大有助于疟疾的诊断准确性。

附图说明

本发明的上述内容及其他目的、特征及其他优势将从下列结合附图的详细描述中得到更清晰的理解，其中：

图1显示由SDS PAGE测得的pvLDH蛋白的表达；

图2显示由凝胶过滤(Superdex200柱)纯化的pvLDH蛋白的分离；

图3为显示ssDNA适体与pvLDH的结合强度的图，所述结合强度根据pvLDH的特异性适体的选择，通过UV分光仪检测；

图4显示由Mfold程序预测的所选择的SEQ ID NO：1(a)的ssDNA和SEQID NO：2(b)的ssDNA的二级结构。

图5显示由EMSA(电泳迁移率变动分析)测得的SEQ ID NO：1的适体和SEQ ID NO：2的适体结合于间日疟原虫乳酸脱氢酶pvLDH和恶性疟原虫乳酸脱氢酶pfLDH的能力(以绿染色，泳道1：pvLDH，泳道2：适体#2，泳道3：适体#2+pvLDH，泳道4：适体#1，泳道5：适体#1+pvLDH，泳道6：pfLDH，泳道7：适体#2，泳道8：适体#2+pfLDH，泳道9：适体#1，和泳道10：适体#1+pfLDH)；