[发明专利]带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系及其制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，同时提供了构建该哺乳动物细胞系的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性和免疫调节功能的糖蛋白，在机体抗病毒天然免疫中发挥重要作用。

研究表明，Ⅰ型干扰素是最早诱导表达的基因，主要通过JAK-STAT信号转导途径激活一系列级联反应。一方面诱导抗病毒蛋白（如ISG蛋白、Mx1蛋白、2-5’寡聚腺苷合成酶、一氧化氮合成酶等）的表达量升高，发挥抗病毒作用，另一方面作用于受感染的细胞，激活相关基因的表达，使机体迅速处于抗病毒的防御状态，建立广泛的抗病毒防御系统。

目前在基础研究和临床应用中，猪干扰素α的产生多采用大肠杆菌表达系统或酵母表达系统。采用大肠杆菌表达的信号肽序列缺失的重组干扰素-α，未经过内质网和高尔基体的加工，缺少天然的IFN-α活性，需要进行复性处理；酵母表达系统存在分泌能力低，背景杂蛋白含量高导致难以纯化，以及过度糖基化等问题。哺乳动物细胞表达系统表达产物在分子结构、生物学功能方面最接近于天然的蛋白质，但表达水平较低。本发明选择pcDNA3.0作为载体在猪PK15细胞中表达猪α干扰素以克服原核表达和酵母表达系统的不足，获得具有接近天然干扰素蛋白活性的基因工程干扰素。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，使猪干扰素在哺乳动物细胞中得到了表达，提供了上述哺乳动物细胞系的建立方法，能够建立带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，提供了稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，是一种带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系。

本发明的技术方案是：带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系，所述猪干扰素α基因具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。

所述猪干扰素α基因的扩增引物具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

带有稳定表达猪干扰素α基因的哺乳动物细胞系的制备方法，它的步骤如下：

（1）利用反转录PCR方法从猪外周血白细胞中扩增猪干扰素α基因；

（2） 猪干扰素α基因插入真核表达载体的多克隆位点上，得到重组表达载体pcDNA-poIFNα；

（3）将重组真核表达载体pcDNA-poIFNα转染并筛选出稳定表达猪干扰素α基因的细胞系。

具体步骤如下：

真核表达载体的构建

参照GenBank上已发表的猪α干扰素基因序列M28623和X57191，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计真核表达引物P3和P4，P3引物带有EcoRⅠ酶切位点，下游引物P4带有XhoI酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段长570bp，同时用DNAstar等软件评价所设计的引物。

上游引物P3：5’TCTAGAATTCATGGCCCCAACCTCAG 3’

下游引物P4：5’TACACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG 3’

PCR 产物经胶回收后用EcoRⅠ/XhoI双酶切，纯化后与pcDNA3.0载体连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布于含Amp的琼脂平板上进行抗性筛选,挑取多个单菌落摇菌进行PCR 鉴定，碱裂解法小量提取阳性质粒并酶切鉴定，测序正确后，构建成功的真核表达质粒命名为：pcDNA-poIFN-α。

稳定表达猪干扰素α基因的PK15细胞系的构建

采用基因工程的方法，将猪IFN-α基因插入到真核细胞表达载体多克隆位点处，得到重组表达载体。

通过脂质体Lipofectamine^TM2000介导的细胞转染以及抗生素筛选技术，筛选出可以表达猪IFN-α基因的细胞系。

本发明的积极效果在于：将构建的pcDNA-poIFN-α大量纯化无菌提取后，利用Lipofectamine^TM2000转染PK15细胞，经G418筛选15天后，获得抗性细胞。采用一系列方法对获得的细胞在基因水平、转录水平和翻译表达水平进行鉴定，获得稳定表达猪干扰素α基因的PK15细胞，采用反转录PCR、实时定量PCR以及酶联免疫吸附试验（ELISA）细胞方法在PK15细胞中检测到猪干扰素α mRNA和蛋白的表达。

附图说明

图1为猪α干扰素基因PCR扩增结果，其中，M1：DL2000Marker，1：猪α干扰素RT-PCR产物。