[发明专利]苏云金芽胞杆菌cry1Ca基因，表达蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt cry1Ca基因及由该基因所编码的蛋白质。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2011年10月)已发现种杀虫晶体蛋白605种，被分为70类cry蛋白和2类cyt蛋白。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2010年，25个国家种植了转基因作物，全球转基因作物累计种植面积超过十亿公顷，19个为发展中国家，排名前十位的国家种植面积都超过100万公顷，其中，有8个是发展中国家，90％都是小型农户。同时，有30多个国家新近批准种植转基因作物，日本、新加坡等国家批准进口转基因农作物。总的来说，已经有59个国家同意种植或进口转基因产品，中国则批准了所有的商业化生物技术，2010我国种植转基因作物350万公顷，排世界第六。转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。

由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。

发明内容

本发明提供一种对鳞翅目害虫小菜蛾、甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌LB-R-78，及其杀虫新基因cry1Ca13基因和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78，其保藏编号为：CGMCC No.5567。

苏云金芽胞杆菌菌株LB-R-78在杀杀灭小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾中的应用。

杀虫蛋白Cry1Ca13，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

cry1Ca13基因，编码杀虫蛋白Cry1Ca13。

优选其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种表达载体，其特征是含有cry1Ca13基因。

所述表达载体为pEB-cry1Ca，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示。

所述表达载体为pSTK-cry1Ca，其骨架载体为pSTK，其结构如图7所示。

一种微生物转化体，其特征是含有cry1Ca13基因。