[发明专利]一种新型高效液相色谱介质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型高效液相色谱介质及其制备方法

背景技术

高效液相色谱(HPLC)是一种强有力并被广泛使用的纯化和分析复杂组分的技术，而传统的高效液相色谱大部分都是基于反相色谱原理的。反相层析(RPC)是根据蛋白质的高表面张力进行吸附，通过降低表面张力进行洗脱的；层析介质上的非极性基团可以和蛋白质或多肽表面的疏水部位进行相互作用；在水溶液中目标物质具有较高的极性而吸附，通过在洗脱液中添加有机溶剂降低极性达到洗脱的目的。传统的高效液相色谱介质大部分都是通过在介质上连接一定长度的碳链，起功能化作用，目标产物吸附后，再用有机溶剂梯度洗脱，具有分辨率高的优点。但是有机溶剂极易造成蛋白质的变性，使高效液相色谱技术在蛋白质的分离应用受到了限制。

具有吡啶基的疏水性电荷诱导型配基属于弱碱性化合物，在pH 4-10的范围内不带电荷，可以避免静电作用对杂质的吸附，配基可以通过疏水作用与蛋白质相结合，而当pH值降低到配基的pKa以下时，杂环质子化，若此时蛋白质也带有正电荷，可通过静电排斥作用实现洗脱。这种以疏水作用吸附、静电排斥协助解析的过程是HCIC的最大特征，可通过将流动相pH降低到4.0-4.55进行洗脱，避免反相色谱中有机溶剂对蛋白质活性的液相。由此可见，疏水性电荷诱导层析是一种应用广阔的新型层析分离方法。

然而大部分的疏水性电荷诱导型层析介质，都以琼脂糖、纤维素等水凝胶为基质材料的，很难应用于高效液相色谱中。氧化硅具有机械强度高、孔隙率和比表面积大、极性可调节和表面易修饰等优点，因而被广泛地用作高效液相色谱介质的基质材料，可通过硅烷化试剂引入所需的配基来制备高效液相色谱介质。

因此，本发明将新型疏水性电荷诱导型配基引入高效液相色谱技术中，以二氧化硅微球为载体，通过硅烷化试剂引入吡啶基，可以提高对蛋白质的选择性和分辨率，并可在较温和的条件下洗脱，形成一种高效的蛋白质分离新方法，有效促进蛋白质分离工艺的改进和提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型高效液相色谱介质及其制备方法。

新型高效液相色谱介质，其介质的组成中基质为多孔二氧化硅微球，功能配基为通过硅烷化试剂引入的吡啶基，具有吡啶基的硅烷化试剂的结构为：

所述的多孔二氧化硅微球的粒径为5-30μm。具有吡啶基的硅烷化试剂的吡啶基包括2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。具有吡啶基的硅烷化试剂的结构中的R构成了碳链，R构成单元为CH₂或CHOH，长度为0-6个碳。配基密度为5-150μmol/mL介质。

新型高效液相色谱介质的制备方法如下：取10-20mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷却后转移至250mL圆底烧瓶中；再加入100-180mL甲苯、2-10g具有吡啶基的硅烷化试剂，通入氮气；升温至50-150℃，100-250r/min下搅拌回流5-24h；反应完毕后，过滤收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干。

本发明所研制的高效液相色谱介质，具有疏水性电荷诱导分离原理，具有制备方法简单、成本低廉、配基密度高、蛋白吸附量大、特异性强和吸附洗脱条件温和等优点，可用于蛋白质的高效分离纯化。制备工艺的关键是：将多孔氧化硅微球充分干燥后，在氮气保护下，于甲苯中与具有吡啶基的硅烷化试剂进行加热反应，一步即可得到新型疏水性电荷诱导型高效液相色谱介质。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

取10mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷却后转移至250mL圆底烧瓶中；再加入150mL甲苯、2g具有吡啶基的硅烷化试剂2-(2-吡啶基)乙基三甲氧基硅烷，通入氮气；升温至80℃，200r/min下搅拌回流12h；反应完毕后，过滤收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干，配基密度为77μmol/mL。

实施例2

取10mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷却后转移至250mL圆底烧瓶中；再加入150mL甲苯、3g具有吡啶基的硅烷化试剂2-(3-吡啶基)乙基三甲氧基硅烷，通入氮气；升温至85℃，200r/min下搅拌回流10h；反应完毕后，过滤收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干，配基密度为79μmol/mL。

实施例3