[发明专利]二羧酸生产工艺

说明书

本发明涉及用于发酵生产二羧酸的工艺。

二羧酸（比如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸）是重要的化合物，其在食品工业中用于食物制备和保存，在医药工业中用于配制药物制品，以及用于其他工业用途，例如（生物）聚合物的单体。可通过石油化学工艺或基于发酵的工艺，由细菌或真菌细胞生产二羧酸。

已研究的用于二羧酸(比如琥珀酸)生产的细菌例如有E.coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或Corynebacteria。

生产二羧酸的合适的真菌细胞有例如酵母，比如Saccharomyces或Yarrowia种，或丝状真菌比如pergillus或Rhizopus种。

开发了用于生产二羧酸的若干工艺。

WO2009/081012公开了在厌氧条件和高二氧化碳浓度下通过发酵Escherichia coli菌株生产琥珀酸的工艺。

WO2008/14462公开了在不同的二氧化碳浓度下通过发酵酵母生产苹果酸和琥珀酸的工艺。

本发明的目的是以十分高的产率生产二羧酸的一种替代工艺。

发明内容

本发明涉及用于生产二羧酸的工艺，其包括在合适的发酵培养基中发酵微生物，其中将在大气压下测量的包含30%至100%v/v的氧的气流添加至发酵培养基；以及生产二羧酸。

本公开还涉及包含30%至100%v/v氧的气流用于在合适的发酵培养基中通过微生物生产二羧酸的用途。

定义

术语“二羧酸”和“二羧酸盐/酯”，比如“琥珀酸”和“琥珀酸盐/酯”在本文中具有相同的含义并互换使用，前者是后者的氢化形式。

本文中使用的术语发酵（fermenting）或发酵（fermentation）是指由碳水化合物微生物生产诸如醇类或酸类的化合物。

根据本公开的遗传修饰的或重组的微生物，或遗传修饰的或重组的微生物细胞在本文中被定义为下述细胞，其含有基因破坏（disruption）或含有微生物细胞中不天然存在的核苷酸序列或所述细胞用微生物细胞中不天然存在的核苷酸序列转化过或遗传修饰过，或所述细胞含有内源核酸序列的额外的拷贝或多个拷贝。野生型微生物细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。

基因破坏、或缺失或敲除表示基因的一部分或全部基因已从细胞中去除，或基因已被修饰使得基因不被转录为原始的编码的蛋白。

当用来表示给定(重组)核酸(DNA或RNA)、基因或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。

当用于核酸(DNA或RNA)或蛋白时，术语“异源的”是指下述核酸、基因或蛋白质，所述核酸、基因或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。

可过表达在本文中公开的重组微生物中的基因。本领域中有已知的方法用于过表达编码酶的基因。可以通过提高细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝基因的（附加体）表达载体，来过量表达编码酶的基因。用（强）组成型启动子实现编码根据本发明的酶的基因的过表达。

用于微生物细胞，比如细菌和真菌的启动子对本领域技术人员而言是公知的。用于真菌细胞的合适的启动子可以是但不限于，TDH1、TDH3、GAL7、GAL10、GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PH05、ADC1、ACT1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1、AOX1、PGL、GPDA和GAPDH。其他合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1和TEF1。

可将编码酶的基因连接进核酸构建体，例如质粒，比如低拷贝质粒或高拷贝质粒中。根据本发明的微生物细胞可包含单个拷贝，但是优选地包含多个拷贝的基因，这例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。