[发明专利]用于增强基因表达的来自核糖体蛋白启动子的核酸片段

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于改进筛选具有高表达水平的宿主细胞的手段和方法。

背景技术

生物活性蛋白在各种宿主细胞中产生，从细菌和酵母菌到哺乳动物细胞。当蛋白质需要某种翻译后修饰如糖基化以发挥适当功能时，优选以哺乳动物细胞作为宿主细胞。通常，在哺乳动物细胞中产生的蛋白质由编码目的蛋白的所谓的“转基因”表达。为确保筛选出正确的产生蛋白质的细胞，将编码目的基因的转基因和编码可筛选标记的第二转基因相偶联，通常它们位于相同的载体上。常见的问题是筛选的严格性很低，这就意味着为了在毒性筛选条件下存活，细胞不得不只产生很少量的选定蛋白。如果细胞的筛选仅需要可筛选标记蛋白的有限表达，那么这也指示了转基因蛋白的表达水平。转基因蛋白的低表达通常伴随着可筛选标记蛋白的低表达水平。这显然是低筛选严格性带来的不良负面影响。

使用博莱霉素筛选标记能够看到筛选严格性的改善。这是因为博莱霉素筛选蛋白不是以酶的形式发挥作用，而是按化学计量与两个博莱霉素筛选分子结合，但不对它们进行进一步加工的形式发挥作用。因此，与单个分子就能够催化许多筛选剂分子失活的酶促可筛选标记蛋白相比，细胞必须产生更多的化学计量上的可筛选标记（例如，博莱霉素筛选蛋白）的分子。当与目的基因偶联时，化学计量上的可筛选标记的较高严格性通常导致较高水平的mRNA和/或目的基因产物的表达。

由于在筛选稳定转染的克隆时仅能针对用于可筛选标记的表达进行筛选，而不能针对目的基因的表达水平进行筛选，因此，优选的是，目的基因的表达和可筛选标记的表达水平有直接的联系。实现该目的的一种方法是通过将IRES（内部核糖体进入位点，Internal Ribosome Entry Site）序列置于目的基因和编码可筛选标记的基因之间。这就产生了单个双顺反子mRNA，双顺反子mRNA翻译目的基因产物和筛选蛋白（Rees et al.,1996,Biotechniques20:102-110）。因此，筛选标记的高水平表达（例如，通过使用高严格性标记）能够和目的基因产物的高水平表达直接耦合。这是一种公认的且常用的用于筛选表达相对高水平目的基因产物的克隆的方法（参见例如WO03/106684、WO2006/005718和WO2007/096399）。

通过使用具有能够减弱但不会完全破坏筛选标记活性的突变的可筛选标记，可以使筛选严格性进一步加强。在相同的筛选条件下，较高水平的受损筛选蛋白需要与野生型筛选蛋白进行比较。当通过IRES序列与目的基因相偶联时，受损筛选标记的较高mRNA水平确保了存在更多能用于翻译的目的基因的mRNA（参见例如WO01/32901和WO2006/048459）。

在另一个高筛选严格性体系的实例中，通过使用可筛选标记蛋白的非优选的、非ATG翻译起始密码子，筛选标记蛋白的翻译起始严重受损。这些筛选体系被称为“STAR-Select”（Otte et al.(2007)Biotechnol.Progr.23(4):801-807;WO2006/048459and WO2007/096399）。

最近，本发明的发明人开发了一种新的严格的筛选原则，通过将短肽的编码序列直接置于筛选标记的上游，从而使筛选标记蛋白的翻译起始严重受损，因此，需要核糖体在筛选标记蛋白的翻译起始密码子处重新起始翻译（尚未授权的申请PCT/NL2010/050367）。在这个体系中，筛选的严格性可以通过增加短肽的长度进行微调：当短肽变长时，翻译机制在可筛选标记蛋白的翻译起始密码子处重新起始的难度将会增加。与博莱霉素可筛选标记蛋白结合时，这种严格筛选体系被称为“ppZeo筛选体系”（pp=小肽（petite peptides））。