[发明专利]复合液体池

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年7月22日提交的美国临时申请顺序号61/344,434、2011年4月1日提交的61/470,515和2011年4月1日提交的61/470,520的权益，所述申请各自通过引用结合到本文中。

背景

目前对生化样品的处理有许多关键性缺陷。这些包括体积大小 — 导致高的试剂成本；高的消耗成本；和劳动强度高的方案和过程，这些非常容易交叉污染。因为这些原因，目前无法保证在生化过程中对每个样品的完全控制和隔离。

对于多个生化过程的应用 — 序列珠制备、焦磷酸测序、核酸连接和聚合酶链式反应 — 和不限于此，体积大小、化学成本、劳动力成本和反应效率的局限是明显的。

序列珠制备是在应用-特定的化学中将小珠包被的过程。例如在DNA复制中，珠子先用DNA引物包被，然后是扩增过程。甚至对于今天的现有技术的测序仪而言，需要相对高的局部浓度的靶分子，以准确测序。目前对典型方案的评价估计，仅80%经处理的珠子被充分包被，以确保准确测序。因此为了确保相对高浓度的靶样品，必须使用大量珠子，以达到统计学准确性。此外，均匀包被的(even coated)珠子从一个孔向另一个转移，都不可避免地导致珠子和悬浮流体的损失。这是目前移液和液体处理系统中固有的死体积和无效性的结果。该生化过程通常是在96孔或384孔静态孔板中进行，其通常的体积范围为10微升至200微升。

另一生化过程，焦磷酸测序，将相当高浓度的核酸与引物-包被的珠混合。核酸附着在珠子上并形成纯系群体(clonal colony)。然后再用基于乳液的PCR将其扩增。测序仪器含有大量皮升-体积的孔，这对于单个珠子连同测序所需的相关酶而言足够大。焦磷酸测序使用萤光素酶来发光作为读出(readout)，并且测序仪器对于每个添加的核苷酸都为孔拍照。该过程中的一个关键问题是珠子被引物有效包被。使用现有技术，一定百分比的珠子并未被引物化学适当地包被，导致较差的反应效率。使用目前的技术来改进珠子的包被效率，将需要试剂成本的不可持续的增加。

在核酸连接中，也出现类似的生化过程的问题。核酸连接在现代分子生物学研究中已经成为重要工具，用于产生重组核酸序列。例如，将核酸连接酶与限制酶一起使用，将核酸片段，通常是基因，插入到质粒中，用于遗传工程。核酸连接是分子生物学中相对常用的技术，其中可通过一种称为连接酶的酶的作用，在特定温度通常16 – 25°C(取决于所用的方案)下，将短链DNA连接在一起。为了将两条以上的短DNA链序列连接在一起，例如在合成遗传序列的构建中，可以将所有DNA链混合，再进行连接。这将会产生随机序列，其中一条链的末端将与错误链的起始端连接。这种错误序列，或方向，在合成构建的基因(其中遗传密码的顺序至关重要)中是不想要的。为了正确进行该技术，必须先将相邻序列的配对组合连接起来，以得到正确方向。再将这些配对合成的构建体以正确方向连接，得到甚至更长的合成构建体。该过程涉及大量而复杂的化学过程和操作。这是非常耗费人力的过程，如果用现有的液体处理，并且导致大的消耗成本，还要遭受静态孔板和移液管吸取的已知的死体积损失。另外，使用现有的液体处理技术，小体积的混合和控制受限于相对小体积的吸取和操作的能力。核酸连接中所用的典型体积是10 – 200微升，且核酸链长介于50 – 200个碱基对。

聚合酶链式反应(PCR)已广泛用于扩增目标DNA和cDNA，用于分子生物学的多种应用。PCR技术扩增单一拷贝或少数拷贝的一段DNA，得到数千至数十亿拷贝的特定DNA序列。现代PCR仪器进行PCR过程的反应体积范围为10–200微升。在小体积中进行PCR的最大障碍之一是难以用手工移液管来操作小体积的组成试剂。大的体积量是现有技术在分配和混合亚纳升体积中性能不佳的直接结果。此外，对于基于流动系统的下一代微流体技术而言，这些依然受限于所分配的起始体积与生化过程所需的实际样品量。这些微流体系统在生化过程期间也受限于确定的样品方案控制。这些系统通常依赖于微量规模的流体通道网络，以转运和混合亚微升体积。这些技术的一些主要缺陷在于：微流体卡(microfluidic card)的单次使用，为了防止污染；缺乏对各单个样品的动态控制，在生化过程的任意点转运和混合任何单个样品；和系统的密闭结构。