[发明专利]提高人干细胞活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备高活性人间充质干细胞团块的方法，由该方法获得的高活性干细胞团块，以及含有该干细胞团块的细胞治疗剂。

背景技术

干细胞能够分化成构成生物体组织的各种细胞，且一般是指从胚胎、胎儿和成人各种组织中获得的未分化细胞。干细胞通过分化刺激（环境）分化成专门的细胞；与细胞分裂已停止的分化细胞不同，它通过细胞分裂（自我更新）产生相同的细胞从而增殖（扩增）；其特点在于其分化的可塑性，它可以在不同的环境下或通过分化刺激，分化成另一种细胞。

根据它们的分化能力，可将干细胞分为万能（pluripotent）干细胞、多能（multipotent）干细胞和单能（unipotent）干细胞。万能干细胞能够分化成所有类型的细胞，如胚胎干细胞（ES细胞），以及诱导的万能干细胞（iPS）。多能干细胞和/或单能干细胞的实例包括成人干细胞。

胚胎干细胞源自囊胚期囊胚细胞的内细胞团。这类细胞的特点在于，由于它们具有分化成任何类型细胞的万能性，它们可以分化成任何类型组织的细胞，与通过生殖细胞产生的成体干细胞不同，它可以在永生和未分化状态中培养，并可以传给下一代（Thomson等人，科学(Science)，282：1145-1147（1998）;Reubinoff等人，Nat.Biotechnol.,18:399-404(2000)）。

制备人胚胎干细胞只能通过从人类囊胚中分离内细胞团并进行培养。目前，世界各地制备的所有的人胚胎干细胞均来自无菌处理后的冷冻胚胎。由于如癌症发展和免疫排斥反应的可能性的问题，各种将万能人胚胎干细胞作为细胞治疗剂使用的方法尚未获得完全成功。

作为替代方法，诱导的万能干细胞（iPS）引起研究人员的关注。诱导的万能干细胞来自分化的成体细胞，通过使用不同的方法，有目的的将其去分化成胚胎状态。据报道，在许多方面，iPS细胞具有与天然的ES细胞几乎相同的性能，包括基因表达和分化能力。在iPS细胞的情况下，可通过使用源自病人的细胞作为来源，可避免免疫排斥反应的可能性，但仍然要面对癌症发展的风险。

近来，有人提议将间充质干细胞作为替代物，以解决与癌症发展和免疫排斥有关的风险。间充质干细胞为多能(multipotent)细胞，能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞等，且已报道具有调节免疫应答的活性。

间充质干细胞可从各种组织例如骨髓、脐带血、脂肪组织中分离得到，且可进行培养。然而，根据它们的起源，其细胞表面标志物彼此不同，因此难以清楚地定义间充质干细胞。在这方面，间充质干细胞通常被定义为具有分化为成骨细胞、软骨细胞和心肌细胞的能力，其特征在于，其呈旋涡状，且表达标准的细胞表面标志物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)。在这方面，基于上述间充质干细胞的定义，这些具有不同的遗传起源和/或背景的间充质干细胞未显示出彼此显著的不同。然而，它们的体内活性通常显示出显著差异。另外，在间充质干细胞作为同种异体细胞治疗剂的情况下，可获得的干细胞池是有限的。因此，当选定的间充质干细胞在体内显示出低活性时，在某些情况下，这类细胞不能被替换，且没有许多可替代的选择。

此外，为了用作细胞治疗剂，间充质干细胞通常必须满足细胞治疗和/或再生医学领域中所需的最小细胞数（约1×10⁹个细胞）。考虑到条件设置和建立标准，实验所需的细胞数目会变得甚至更大。在来自各种起源的常规间充质干细胞的情况下，至少要进行10次体外实验传代才能够获得该数目的细胞。在这种情况下，细胞会老化并发生变化，这将使它们不能够满足在治疗中使用。

因此，为了有效地将间充质干细胞作为细胞治疗剂使用，需要开发一种新的方法，即使在仅有少量干细胞的情况下，该方法也能够通过诱导出高活性间充质干细胞，最大限度地提高间充质干细胞的治疗效果。

发明概述

本发明目的是提供一种从老化的或体内活性相对低的间充质干细胞制备高活性干细胞团块的方法。

本发明另一目的是提供由上述方法制备的高活性间充质干细胞团块以及包含其的细胞治疗剂。

根据本发明的一个方面，提供一种制备高活性人间充质干细胞团块的方法，包括克服重力培养人间充质干细胞以形成球状细胞团块（spherical cell aggregate）。

根据本发明的另一个方面，提供一种通过上述方法制备的高活性间充质干细胞团块及包含该干细胞团块的细胞治疗剂。