[发明专利]一种生物素的酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测含维生素食品和维生素产品中的生物素含量的酶联免疫试剂盒，属于食品成分的检测分析技术领域。

背景资料

生物素又名维生素B₇、维生素H等，分子式为C₁₁H₁₈O₃N₂S，由咪唑酮环和一个带戊酸的四氢噻吩环结合而成，为含硫的单羧酸环。生物素是机体维持正常生理机能所必需的一种维生素，是一项重要的营养指标，同时也是重要的食品添加剂之一，对人和动物的新陈代谢意义重大。其作为羧化、脱羧和脱氢反应酶系的辅助因子，是丙酮酸羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶和β-甲基丁烯酰辅酶A羧化酶的羧基载体，在脂类、蛋白质、碳水化合物和核酸的代谢过程中起重要作用。愈来愈多的研究表明，生物素不仅是动物正常生理活动的必需酶的辅助因子，还有促进免疫器官生长，增强免疫机能的作用。无论人还是动物缺乏生物素都会出现食欲下降、生长缓慢、脱发或神经受损等问题，孕期生物素缺乏对人类还会有潜在致畸性。成人每天需要100至200毫克的生物素。由于生物素的独特功能，已被广泛应用于医药、维生素制剂、饮料、婴幼儿食品、饲料添加剂等行业中。

近几年，生物素的发展越来越多地受到人们的关注。生物素检测方法的研究，更是成为很多行业的研究焦点。目前，用于生物素测定的方法主要有生物法、化学法、酶法、微生物法和高效液相色谱(HPLC)法。其中，生物法由于其实验周期长，人力、物力消耗多，逐渐不被使用；化学法和酶法的灵敏度受样品种类变化的影响较大，适用范围较窄，有待于进一步改进。微生物测定法灵敏度高但准确度不高，且耗时长，对操作人员的技术要求较高。如果有较完整的前期样品处理方案，HPLC法将会是一种更为稳定、快速的方法。但其缺点在于仪器设备造价过高，且样品的前处理较为复杂，不适合成分复杂、杂质干扰大的样品测定。与HPLC法相比，免疫分析法作为一种测定生物素的新型有效的方法，近年来获得迅速发展，并投入商品化应用。

酶联免疫(ELISA)法测定原理基于抗原-抗体反应，省去了样品冗长而繁琐的前处理过程，更适合于成分较为复杂难于分离处理的样品检测。该法已广泛应用于各种生物大分子(如细菌、病毒及蛋白质等)、小分子(半抗原)物质等的检测。目前报道的检测生物素的ELISA法大多基于生物素-亲和素系统，生物素与亲和素有相当强的亲和力(Kd＝10^-15M)，已被广泛用于细胞化学、免疫组织化学、免疫测定等。但是生物素-亲和素系统中，亲和素是一种高碱性(pH＝0.5)糖蛋白，易引起较强的非特异性结合。最近Bager报道抗生物素抗体有模拟亲和素功能的作用，并显示较好的特异性。

发明内容

本发明的目的是解决传统检测方法存在的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的，用于检测牛奶、奶粉、饮料等含维生素食品和维生素产品中生物素含量的酶联免疫检测试剂盒及方法。

本研究在获得完全抗原，制备抗生物素特异性抗体的基础上，建立了针对生物素的间接竞争ELISA检测方法，用于定量检测含维生素的食品和维生素产品中的生物素含量，结果表明该方法简便、快速、特异性强，灵敏度高。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被生物素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入生物素特异性抗体溶液，样本中的生物素或生物素标准品与酶标板上包被的生物素偶联抗原竞争生物素特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中生物素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中生物素的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度生物素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中生物素含量的浓度范围。

本发明提供的生物素的酶联免疫检测试剂盒中试剂的组成包括：

(1)包被有生物素包被抗原的酶标板；

(2)生物素的特异性抗体；

(3)酶标记抗抗体；

(4)生物素标准品溶液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)底物显色液；

(8)终止液。

其中：所述的生物素包被抗原是将生物素半抗原与卵清蛋白偶联得到的，生物素包被抗原的浓度为0.2～1μg/ml。

所述生物素特异性抗体是由生物素与分子量范围是6.7KDa～6.8KDa的牛血清蛋白的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述生物素特异性抗体的工作浓度为1∶20000。