[发明专利]微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物分离和富集技术，尤其是一种微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备技术及其应用。

背景技术

盐酸克伦特罗是一种β-兴奋剂，可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被养殖户或养殖企业作为生长促进剂大量使用，导致畜产品中盐酸克伦特罗大量残留。人食用这类畜产品后，可引发肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，严重危害消费者的健康。因此，许多国家(包括我国)现已被明令禁止在饲料中添加克伦特罗来增加动物的瘦肉率，畜产品中禁止克伦特罗含量超标。因此，对动物来源的食品中盐酸克伦特罗残留进行严格地检测是非常重要。

目前检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC-UV)、气-质联机法(GC-UV)、酶联免疫法、胶体金快速试纸条检测法等，由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少，而我国明确规定禁止克伦特罗及其衍生物在动物的饲养过程中使用。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的克伦特罗，可以很大程度的提高分析结果的可靠性和分析的极限。所以发明高效可行的克伦特罗免疫亲和柱很有必要。

现有的克伦特罗免疫亲和色谱样品处理柱的技术与工艺存在的缺陷：

目前关于纯化克伦特罗亲和色谱柱的专利和学术报告，仅仅是停留在实验室水平，即仅仅实现了可能性而无法在生产上应用的可行性。原因分析如下：

1)亲和柱重要的原料之一---活化填料。采用商业提供溴化氢(Cyanogen bromide)活化琼脂糖(Agarose).该种活化已知的缺陷是化学性质不稳定，化学反应残余有离子交换性质。这样会导致填料所结合的抗体定期性脱落，使结果不准确性和不可靠。从而限制了该填料的用途。

2)亲和柱重要的原料之二-----抗体。采用的抗体不是抗原特异亲和纯化的高质量抗体，会导致特异性抗体在填料的偶联比率低从而导致亲和柱的效率低下。即使使用单克隆抗体为原料的亲和柱专利，抗体生产成本高，很难实现实用性。

3)抗体偶联技术。采用的是溴化氰(Cyanogen bromide)活化偶联技术。该技术已知缺陷是化学键不稳定，会定期脱落，造成偶联的抗体固定不稳定，偶联抗体后的填料依然具有离子交换特点从而影响效率和分析结果的可靠性。。

非特异亲和纯化抗体制备和不稳定的偶联技术，导致填料的抗原(克伦特罗)结合效率极低。无法用于制备微型化亲和柱。填料的装柱容量多在1毫升左右，与25微升微型柱的水平差异是50倍。

4)没有微型化亲和柱。抗体填料的技术和低质量抗体使单位体积的亲和填料与分析物抗原的结合效率低，所以无法微型化。没有微型化，需要填料体积大，导致待测抗原洗脱的体积同样过大，直接影响了分析抗原的富集效应。同时，由于抗体抗原反应是动力学过程，填料中抗体的质量差，直接影响了抗体抗原反应的速率，也影响了富集的效率。富集效率直接影响到抗原分析物的检测极限。这是现有克伦特罗免疫亲和色谱柱最大的缺陷。上述几方面的原因造成制备出来的亲和色谱柱对待测样品中的克伦特罗富集的效率和纯化的能力差，引起检测灵敏度差、准确率低、可靠性低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备高效、准确、可靠的工具和方法的技术。这样的工具(产品)可以把待检样品中克伦特罗的定量定性的分离纯化和富集起来，以便进一步的分析。

要达到这个目的，需要解决的问题是：

1)高度化学稳定和高效化学偶联的固相活化填料的制备技术。只有化学稳定的固相填料，才能保证所固定的富集物特异抗体的稳定不脱落，才不至于影响和干扰分析的结果和富集的效率，才有实用推广和商业化的价值。

2)大量廉价的高质量克伦特罗特异抗体的制备技术。只有高纯度、高度特异的抗体才可能达到单位体积最大的抗原分析物的富集效果和实现亲和柱微型化的目的。

3)高密度抗体固定技术。只有高密度地将抗体固定于填料，才可能达到单位体积最大的抗原分析物的富集效果和实现亲和柱微型化的目的。

本发明的原理：

克伦特罗亲和纯化和富集技术的基本原理是：把克伦特罗特异抗体通过化学方法固定倒固体琼脂糖小球(Agarose Beads)上。在流体样品中的抗原分析物克伦特罗(Ag)与固相填料中的克伦特罗特异抗体(Ab)产生特异性反应，在固相生成抗原抗体复合物。即：

目标微量的克伦特罗流经固相的分析物特异抗体，被抗体俘获而积累富集，同时流体样品的杂质可以从固相中自由流出而被清洗干净而使得克伦特罗得到纯化。