[发明专利]一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法。 

背景技术

雌激素(estrogen，E)在生物体内具有广泛的生物学活性，不但对众多靶组织如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系统有调节作用，还可作用于与认知功能相关的神经回路，参与5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸、GABA和乙酰胆碱等神经递质和多种神经肽活动的调节，影响突触可塑性和学习记忆。同时，雌激素在神经细胞的分化和发育、神经元存活和轴突生长的诱导以及新生神经元的形成等诸多过程中也发挥重要作用。阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种严重威胁老年人身体健康的神经退行性疾病。已知雌激素替代疗法能够改善脑功能的退化，降低绝经期后女性AD发病率，而生理水平的雌激素可减少伴随AD产生的神经毒性蛋白。雌激素替代(HT)能改善绝经期后女性学习记忆等脑功能，但同时又具有诱发子宫内膜癌和乳腺癌的封信啊。雌激素拮抗剂可作为乳腺癌术后复发防止药物，但同时也可减弱患者的记忆功能。 

雌激素受体(estrogen receptor，ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，能够与雌激素特异性结合，通过基因组作用模式调控靶基因的转录或激活细胞内信号，改变胞内蛋白功能和调控基因表达。雌激素受体主要分为ERα和ERβ两种类型。近年来，随着研究的不断深入，又陆续发现新的ERα受体亚型。目前，ERα分为ERα66、ERα46、ERα36三种亚型。其中，ERα36是由Wang等在2005年克隆并鉴定出的一种新型雌激素α受体。研究发现，在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织中，均有ERα36的表达，并参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等病理过程。但ERα36在神经系统中的表达及其功能还未见报道。 

shRNA是short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制。随后在连上5～6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理。 

PC12细胞株(pheochromocytoma cell line，PC12)源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，神经嵴源性，有较典型的神经内分泌细胞特性，胞膜上有胆碱能M和N受体等，常作为多巴胺能神经元的细胞模型。通常，它们在含血清的培养基中可增殖，呈现未分化状态，而在加入NGF后细胞分化为交感神经元的形态。同时研究还发现，神经元样的PC12细 胞可以发生增殖，因此，常被用作研究神经细胞分化的体外细胞模型。 

目前对于ERα36的研究主要集中在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织或细胞中，对于其在神经系统中的表达及功能的研究还未见报道。雌激素的这种诱发乳腺癌和神经保护的双刃剑作用是否可以通过ERα36来调节，还值得我们进一步研究。因此，我们利用ERα36-shRNA转染PC12细胞建立ERα36敲低的PC12细胞模型，为探讨ERα36在中枢神经系统中的作用提供可行的细胞材料。 

发明内容

本发明为ERα36敲低的PC12细胞系的建立，通过应用siRNA技术，利用ERα36-shRNA转染PC12细胞，建立ERα36敲低的PC12细胞株，再利用免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blot技术对细胞株进行检测，证明细胞株建立成功。 

本发明通过下述技术方案实现： 

本发明的一方面在于提供一种ERα36敲低PC12细胞株的构建方法，其包括如下步骤： 

(a)构建含有碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的pRNAT-U6.1/Neo重组质粒； 

(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株； 

(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选10～14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15％新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL； 

(d)在15％NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250μg/mL，在37℃的5％CO₂培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基；