[发明专利]一种脱除崇明水仙病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属植物组培脱毒技术领域，涉及一种脱除崇明水仙病毒的方法，具体涉及一种利用医用抗病毒药物脱除崇明水仙病毒的方法。

背景技术

我国水仙栽培历史悠久，大约1300多年前就开始了引种与栽培。水仙是我国十大名花之一，素有“凌波仙子”之美称，具有重要的观赏价值和经济价值。目前我国水仙的主要产地为福建的漳州、厦门、福州、上海市的崇明岛及浙江的普陀地区。这些地区栽培的水仙均属多花水仙(Narcissus tazetta)变种(N.tazettavar.chinensis Roem)。

崇明水仙作为上海的传统花卉之一，在崇明县栽培已有上百年历史，以合兴乡的栽培面积为最大，享有“水仙之乡”的盛名。作为上海地方特色花卉、特色资源，“崇明水仙”是上海唯一具有地理标志性的花卉品种资源，崇明水仙曾经因其浓郁的芳香而著称于国内外花卉市场。但在最近的几十年，崇明水仙的生产数量和品质不断下降，最严重时几乎没有开花种球上市。造成这种局面的主要原因在于长期无性繁殖使得崇明水仙的品种退化。并且，崇明水仙在长期栽培过程中还严重遭受病毒的侵染及其危害，在植株上主要表现为花叶、斑驳、褪绿、黄化、坏死和哑花，或花变小、花剑明显减少、香味淡，以及整个植株矮化畸形、鳞茎变小、生长势差、抗性减弱等缺陷，这已成为影响崇明水仙花品质和产量的主要原因之一。

据报道，目前崇明水仙主要存在以下3类病毒：①水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，简称NCLV，Genbank登录号为EU200454)；②水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，简称NDV，Genebank登录号为EU200456)；③水仙斑驳相关病毒(Narcissus mottling-associated virus，简称NMaV，Genebank登录号为EU182651)；其中，在36份崇明水仙田间病样中，NCLV、NDV和NMaV检出率分别为11.1％、13.9％和100％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种脱除崇明水仙病毒的方法，该方法操作简单，成本低，脱毒效果显著，能在短时间内获得大量崇明水仙的脱毒种源，用于快繁和工厂化生产，恢复崇明水仙种源商品性和观赏性，提高种植户的经济效益。

本发明的脱除崇明水仙病毒的方法，通过采用植物组织培养脱毒技术，选择试管籽球作为脱毒材料，利用医用抗病毒药物可以将崇明水仙的主要病毒完全脱除或显著降低病毒含量。该方法有效提高了脱毒效率，并且可以立即对脱毒后的种球在无菌条件下进行扩繁，极大提高了脱毒材料的利用率。

具体来讲，本发明的脱除崇明水仙病毒的方法，包括如下步骤：

1、试管鳞茎的病毒脱除

将增殖培养产生的崇明水仙鳞茎，选择直径＜0.5cm的切分成单个鳞茎，接种在含抗病毒药剂的脱毒培养基上。20-25℃，湿度70-80％，8-10h/d、光照条件下进行脱毒培养，光照强度为1500-2000LX，其中，所述脱毒培养基包括MS培养基以及下述组分：

2、病毒检测

剪取脱毒处理后的崇明水仙试管球上的叶子作为病毒检测材料，RT-PCR进行病毒检测。步骤如下：

2.1叶子经液氮研磨后用RNArose Reagent试剂盒提取崇明水仙总RNA，于-70℃冰箱保存备用。

2.2引物设计

2.2.1水仙斑驳相关病毒(NmaV)检测的寡聚核苷酸引物

反转录引物：CMV-2(5’-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3’)。

巢式PCR第一轮引物：NmaV-POL简并引物(5’-CARTCNGCHAWDKCTAA-3’)(R＝A or G；N＝A，C，G or T；W＝A or T；H＝A，T or C；D＝A，T or G)；CMV-2(5’-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3’)。

巢式PCR第二轮引物：NmaV-1(5’-CTGTCAAGCGTGATGCTACCC-3’)；NmaV-2(5’-CTCCATCTCCACCAGCTTCCT-3’)。

2.2.2水仙退化病毒(NDV)检测的寡聚核苷酸引物

反转录引物：M4T(5’-GTTTTCCCAGTCACG AC(T)16-3’)。