[发明专利]兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用

权利要求书

1.一种兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，包括如下的步骤：

1)制作改良Hulth兔关节不稳模型4～6周后，无菌手术分离兔膝关节；

2)将胫骨平台软骨下骨皮质区削为小骨片，经I型胶原酶-EDTA复合酶消化0.5～2小时，I型胶原酶单独消化2次，第1次12-20小时，第2次1～4小时，弃净消化液；

3)将骨片接种于血清包被的12孔板内，分次加入培养液培养，每2天换液，注意手法轻柔，勿使骨片漂起；

4)骨片贴附7～14天开始有细胞从骨片边缘爬出，制备出软骨下骨成骨细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的骨片来源于胫骨平台软骨下骨皮质区，大小为0.5～3×0.5～3×1mm。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的I型胶原酶-EDTA复合酶浓度为0.05～0.5％I型胶原酶及0.01～0.05％EDTA，消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的I型胶原酶单独消化浓度为0.05～0.5％，第1次消化条件为24～30℃，第2次消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养液为包含5-20％胎牛血清的高糖DMEM。

6.根据权利要求1所述的培养方法得到的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞，其呈短梭形或三角形，胞体透亮。

7.根据权利要求1所述的培养方法得到的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞在评价调控软骨下骨代谢及重塑药物疗效中的应用。