[发明专利]一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法

权利要求书

1.一种克隆山羊PID1基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、从健康的山羊腹肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：以哺乳动物该基因的保守区作为模板在起始密码子上游和终止密码子的下游设计保守引物；设计的引物为：

上游引物P1：5′-CCCCGCGGCTGGAAGATGTG-3′

下游引物P2：5′-TCCACACTCCCACCCTCCTCA-3′

用cDNA为模板进行梯度PCR，优化PID1基因普通PCR的条件，温度为范围在50℃到65℃之间的8个温度点。PCR反应体系为10ul体系(5μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反应条件为95℃预变性5min，38个循环(94℃，30s；61℃，40s；72℃，40s)，最后72℃ 7min；

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1包括以下步骤：用液氮将腹肌磨成粉末装入1.5ml的EP管，放入-80℃的超低温冰箱中备用；取新的1.5ml的EP管，加入1ml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后冰上放置5分钟；加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，4℃下13000rpm离心8分钟，取上层水相于一新的离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置5分钟，4℃下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入1ml的75％乙醇漂洗RNA中混合的杂质，4℃下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，瞬时离心后小心倒置EP管用移液枪引导管内液体流出，尽量吸干，加入适量的DEPC水；琼脂糖凝胶检测RNA的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤：

a.将60μl PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳。用干净的手术刀割下所要回收的DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管称取重量。

b.按每0.1克胶块加入200μl溶胶液；于50℃水浴放置，并不断温和地上下翻转EP管，凝胶完全溶解为止；

c.溶解后的凝胶溶液全部加入到有吸附柱的收集管中，12000r/min离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

d.向吸附柱加入700μl漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；

e.向吸附柱加入500μl漂洗液PW，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液；将吸附柱彻底晾干，以防止残留漂洗液影响下一步的试验；

f.将吸附柱置于另一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空加入30uL洗脱液，室温放置2min，12000r/min离心1min收集DNA溶液；

g.取2uL回收产物于1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3包括以下步骤：

(1)目的片段与载体连接：

将回收、检测后的目的片段与pMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD-18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为：

以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16℃在PCR仪中连接12h，-20℃保存备用；

(2)大肠杆菌感受态细胞的制备：

a.从无抗生素平板上挑取新鲜的E.coli JM109单菌落结种于10ml LB液体培养基中，37℃，250r/min摇菌培养过夜；

b.取2ml活化过夜的菌液接种于含50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃，250r/min摇菌培养至OD₆₀₀＝0.3；

c.将细菌培养物无菌操作下转移至50ml EP管中，冰浴10min，然后4℃4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；

d.加入20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬细胞，用吸管吹散，冰浴30min。再次4℃4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；

e.加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬细胞，用吸管吹散，4℃冰箱中放置过夜；

f.按200ul/份加入15％冰预冷甘油，混匀分装，-70℃冻存备用；

(3)连接产物的转化：

a.吸取10ul连接物介入冰预冷的1.5ml EP管中，再取出-70℃冻存的E.coli感受态细胞置于冰上融化，轻弹管壁使细胞混匀；

b.小心吸取100μl细胞悬液加入到含有连接产物的EP管中，轻弹管壁，混匀后冰浴30min；

c.42℃水浴热激90sec，立即冰浴3min；

d.加入500μl预热至37℃的LB液体培养基，37℃，250r/min摇菌培养45min；

e.吸取200μl菌液，用灭菌涂布器均匀布于加有Amp的LB固体培养基平板上，室温温浴至完全吸收，37℃培养箱中倒置过夜培养；

(4)阳性菌落的筛选：

随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取20μl交送北京六合华大工程技术有限公司完成测序。