[发明专利]人血清糖化白蛋白检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒。

背景技术

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，是危害人类疾病的几大疾病之一。

人体血清中白蛋白占血清蛋白的66％，其余为免疫球蛋白；血清中葡萄糖与血清蛋白的N-末端发生非酶促的糖基化反应，生成糖化血清蛋白，而糖化白蛋白则占糖化血清蛋白的90％以上。另外，由于白蛋白在血清中含量稳定存在，而球蛋白则会由于感染等疾病因素造成波动；故准确测定糖化白蛋白对准确反应糖尿病的的血糖控制情况非常重要。

所以如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白，其反应原理为首先使用蛋白酶将糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应生成多肽(或氨基酸)、葡萄糖醛酮和H₂O₂，释放的H₂O₂通过终点反应比色法来测定，其在600nm处的吸收值与糖化白蛋白的浓度成比例。具体反应过程如下：

而目前市场上的酶法糖化白蛋白存在下述缺陷：

(1)不能完全排除球蛋白的干扰：所采用的蛋白酶底物特异性差，对血清中所有蛋白种类都可以进行分解，故无法排除球蛋白的干扰；

(2)试剂盒稳定性差：因为偶联为Trinder反应，而该反应易受到还原性物质的干扰，由于目前大量输入抗坏血酸等还原性物质的缘故，很多病人血清中高的还原物质对反应造成很大的干扰；而去除抗坏血酸所采用的抗坏血酸氧化酶又容易受到蛋白酶的分解；蛋白酶自身也可以发生自分解反应，稳定性差；

(3)试剂盒成本高：为了将糖化白蛋白完全分解为糖化氨基酸，以便参与下步反应，故采用高浓度的蛋白酶，所采用的酶量也很高，故导致试剂盒整体成本很高；

(4)目前市场上现有的糖化白蛋白没有给出参考范围，只给出糖化白蛋白/白蛋白的参考范围，对于临床的指导有一定的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，该试剂盒能排除人血清中球蛋白及抗坏血酸的干扰、稳定性好、成本低。

本发明所采用的技术方案为：

一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂1和试剂2，其中：

试剂1：

试剂2：

其中，所述蛋白酶共表达体指将蛋白酶的基因与抗坏血酸氧化酶的基因克隆到同一载体上，然后将该载体转化宿主菌，在同一宿主菌中实现小分子的蛋白酶与大分子的抗坏血酸氧化酶的共表达，而得到的含有蛋白酶、抗坏血酸氧化酶这两种酶的蛋白质。

所述蛋白酶的基因可以为任一来源的包含有蛋白酶基因序列的基因，优选为曲霉属或芽孢杆菌属或麦轴梗霉属来源的基因，进一步优选为酶活力高的林伯氏白色念球菌(Tritirachium album libmer)来源的基因，得到的蛋白酶为蛋白酶K(Proteinase K)。从NCBI的GENBANK上可以找到该酶的全基因序列。

所述抗坏血酸氧化酶的基因可以为任一来源的包含有抗坏血酸氧化酶基因序列的基因，优选为植物来源的基因，进一步优选为黄瓜(Cucumis sp.)来源的基因。从NCBI的GENBANK上可以找到该酶的全基因序列。

表达体系可以采用原核或真核表达体系，只要其能实现正确表达即可，优选原核表达体系，因为原核表达体系的背景较为简单，且周期较短。

所述蛋白酶共表达体表达出的蛋白酶和抗坏血酸氧化酶的N端均有5-30个氨基酸片段的增加，即在分子克隆的时候在两者序列的5’端均加入15-90bp的核苷酸序列(对应5-30个氨基酸)，这些氨基酸的主要功能为：

1、方便两种酶的连接，包括酶切位点等；

2、确保两种酶正确构象的形成，从而保证两种酶的活力；

3、增强蛋白酶针对白蛋白的特异性；

4、避免蛋白酶对抗坏血酸氧化酶的分解作用；

5、加入合适的标签，便于后期的分离纯化。

所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。