[发明专利]一种检测植物乳杆菌ST-Ⅲ的PCR检测方法及其引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的PCR检测方法及其引物和试剂盒。

背景技术

益生菌是指当摄入一定数量，能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成，对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物。近年来，随着其益生作用的相继发现，益生菌制品的生产及销售量也呈逐年上升趋势。然而目前市场上对益生菌制品质量的监管和认证，尤其是在对其进行定性、定量检测和鉴定方面缺乏科学、合理、快速的方法，这导致菌种滥用，鱼目混珠的现象经常出现，使得产品质量良莠不齐，严重地阻碍了益生菌制品的发展。

随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，已成功介入到益生菌的鉴定领域。然而由于同种细菌不同菌株间的相似性超过99％，常用的分子生物学手段仍很难从菌株水平对益生菌进行区分。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量益生菌菌株的基因组图谱已被解析出来。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为同种细菌不同菌株间的区分和鉴定奠定了基础。

在乳业发达的国家，都十分重视保护特有的益生菌菌株，如荷兰DSM公司、芬兰的维里奥公司等。他们对其筛选出的益生菌菌株都进行了分子标记并进行了专利保护。我国益生菌的研究起步较晚，少数筛选出来的优良的益生菌株也没有进行及时的专利保护，这为其将来的应用和发展埋下了隐患。

植物乳杆菌ST-III是一种从泡菜中分离得到的具有降胆固醇、降血脂、粘附肠道上皮细胞等多种功能的益生菌，其全基因组图谱已于2010年测定并公布。同时该菌株已作为生产发酵剂在光明乳业有限公司正式投产上市，市场反映良好。为了防止植物乳杆菌ST-III菌株在未被授权的情况下被添加到其他益生菌产品当中，更好的保护该菌株的合理合法使用，从菌株水平对该菌株进行分子标记，寻找特异性的检测方法便显得尤为重要，迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前尚不存在植物乳杆菌ST-III菌株分子检测手段的现状，提供一种快速、特异性强、灵敏度高、成本低的植物乳杆菌ST-III菌株的分子生物学检测方法。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一为：一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III菌株的遗传标记分子，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因。

KilA结构域蛋白(KilA domain protein)是一类DNA结合蛋白。编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因的核苷酸序列较佳的是GenBank Accession No.为YP_003924036.1。优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个。更优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸。所述的遗传标记分子最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第360位至第601位所示。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之二为：一种检测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III菌株的引物对。

该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp。优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的特异性扩增植物乳杆菌ST-III菌株的引物，根据本发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO：1)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之三为：一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物。其中，所述的引物如上所述。所述的试剂盒较佳的还包括dNTP，10×PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。更佳的，所述的试剂盒还包括阳性对照或者基因抽提试剂。