[发明专利]一种猪O型口蹄疫合成肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪O型口蹄疫合成肽疫苗及其制备方法。 

背景技术

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth virus，FMDV）引起猪、牛、羊等偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量安全，被OIE列为A类重要传染病。目前对于该病的防制发达国家主要采取屠杀政策，发展中国家采取隔离和免疫接种政策，其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效手段。我国目前通过接种灭活疫苗及合成肽疫苗等一些新型疫苗来控制该病的流行。但现有的这些疫苗都存在一些缺陷。如灭活疫苗主要缺点是生物安全性问题及稳定性问题，病毒必须在高度要求的设备中生产，以防散毒；现有的合成肽苗虽然具有良好的保护效果，但生产工艺复杂，成本高不利于降低成本。因而一种廉价、安全、高效的疫苗生产系统的开发具有巨大的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有合成肽疫苗中存在的生产工艺复杂，成本高的问题，提供一种廉价、安全、高效的猪O型口蹄疫合成肽疫苗。 

本发明另一目的在于提供上述疫苗的制备方法。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一种猪O型口蹄疫合成肽疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述氨基酸序列采用的是猪O型口蹄疫VP1蛋白中具有抗原性的141-160位及200-213位氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头；抗原多肽采用如下串联结构：Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分别代表猪O型口蹄疫VP1蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分别代表“Pro-Gly”二肽接头及十一肽接头，所述十一肽接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明上述猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法包括如下步骤： 

（1）应用重组DNA技术，合成编码猪O型口蹄疫合成肽的DNA序列，构建pGAPZαA-SP表达载体。

（2）重组表达载体pGAPZαA-SP转化宿主细胞毕赤酵母中，构建表达工程菌：将感受态P.pastoris X33(80μL)与Bln线性化的pGAPZαA-SP (10 μg)相混合，1.5 kV、200电击5 ms。将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板（含100 μg/ml Zeocin）上，将平板倒置，于30℃温箱中培养至单菌落出现（需要3-5 d）。采用煮—冻—煮法制备PCR 模板分析P.pastoris 转化子，以引物能扩增出约200bp的克隆子定为阳性转化子。再经不同浓度Zeocin 的YPD平板筛选高拷贝克隆，以用于高效表达目的蛋白。 

（3）发酵培养重组酵母菌，进行表达，表达产物作SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定； 

（4）表达产物纯化，并选用佐剂乳化制成新型的猪O型口蹄疫合成肽疫苗。

作为一种优选方案，上述方法中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体。 

作为一种优选方案，上述方法中，所述步骤（3）具体为用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin 抗性的单菌落，挑于5 mL 的YPD 液体培养基中进行一级培养，28℃-30℃，200 r/min 振荡过夜，至OD600=2-6，此时细胞处于对数生长期；取1 mL一级培养液，重悬于30 mL 的YPD 中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎。培养72小时，3000 r/min 离心5 min，收集培养液上清，即得纯化蛋白。 

作为一种优选方案，上述方法中，所述步骤（4）中所述佐剂为进口油乳佐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

毕赤酵母菌作为外源基因真核表达系统，具有较高的表达量。用毕赤酵母基因表达系统生产蛋白质具有很大的发展前景，国外已有多种蛋白酶及抗体基因得到了高效表达,一些已经商品化生产。酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。本发明选用野生型毕赤酵母菌X33，生长速度快，而且自身分泌内源性蛋白很少，这就大大减少了我们对培养基中的外源基因表达产物的纯化，有助于提高表达量。 pGAPZαA 为一种非诱导分泌型表达载体, 不需甲醇诱导，所表达异源蛋白直接分泌到培养基中，便于目的基因表达产物的纯化，且培养基价格低廉，更利于实现工业化生产。