[发明专利]一种分离羊肚菌菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用菌柄内侧环割法分离羊肚菌菌种的方法，属于生物技术领域。

技术背景

羊肚菌隶属真菌界(Kingdom Fungi)子囊菌门(Ascomycota)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Peziales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)，一种珍贵的野生食药兼用大型真菌，营养丰富，风味奇鲜，是食用菌中的佳品，被认为是仅次于块菌的美味食用菌，深受人们的喜爱。

羊肚菌最早记载于《本草纲目》，中医认为“性平、味甘，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能，对脾胃虚弱、消化不良、痰多气短、头晕失眠有良好的治疗作用。羊肚菌有机锗含量较高，具有强健身体、预防感冒、增强人体免疫力的功效。羊肚菌含有大量人体必需的矿质元素，每百克干样钾、磷含量是冬虫夏草的7倍和4倍，锌的含量是香菇的4.3倍、猴头的4倍；铁的含量是香菇的31倍、猴头的12倍等”。除富含蛋白质、多糖、核酸、各种微量元素和维生素等活性物质外，还含有丰富的脂肪酸，故其在食品、保健品、医药、化妆品、化工、纺织等领域有广阔的应用前景。现代医学研究又表明，羊肚菌能增强人体免疫力、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳，并且能够减轻癌症患者放疗、化疗引起的毒副作用。由于羊肚菌药食同源，需求量大，价位高，对其进行研究很有必要。野生羊肚菌资源分布较广，我国陕西、甘肃、青海、四川、云南、河北、内蒙、吉林、黑龙江等20多个省份均有分布，但近年来羊肚菌自然采收量越来越少。十多年前，羊肚菌国外有栽培成功报道，已申请技术专利，国内也有栽培成功的报道，但基本处于试验性阶段。

羊肚菌目前报道的分离菌种的方法主要有以下几种：黄保敬对采用羊肚菌茵柄基部土壤分离羊肚菌菌种的方法进行了初探，对土壤中菌丝量大，湿度保持较好的成功率较大。董雪采用单孢分离得到了60株黑脉羊肚菌菌株，赵丹丹等在尖顶羊肚菌孢子悬液分离到了菌种。还有一种为陈吉岳等将子实体掰开，用刀尖轻轻挑取内表面约大小的菌块接入平板培养基，经过多次纯化获得分离菌株。王仲勇用无菌刀片把子实体切成绿豆大小的组织块在0.1％的升汞溶液消毒后分离到了菌种。任桂梅等则用陕北野生羊肚菌子实体进行了的组织和孢子母种分离研究，证明组织分离成功率高于孢子分离。而他采用的组织分离方法则是用无菌眼科剪分别剪取菌盂和菌柄内带无菌组织(如绿豆)，但这样的前提是柄基部没有孔口和裂缝。

孢子分离法由于变异因素的影响，单核菌丝即使双核化，仍然对后续栽培结实不可预测。大多数科技工作者仍然以组织分离的方法获得菌种。但是，羊肚菌与其他大型真菌的子实体在结构上有一些特殊地方，子实体中空，菌肉比较薄，分离时污染率较高。另外，羊肚菌对消毒液具有较强的吸附作用，一旦吸附了消毒剂，萌发就会困难，甚至对羊肚菌的菌丝有致死作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不用消毒剂，既容易萌发，同时也能降低污染，并能较顺利的分离到羊肚菌菌种的分离羊肚菌菌种方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种分离羊肚菌菌种的方法，包括以下步骤：将胶带封闭的羊肚菌用75％消毒酒精均匀擦拭后，用烧灼的刀具从菌柄顶端在火焰上方切割掉子实体头部，露出的新鲜菌柄横切面，在火焰上轻快过2-4下，用刀具在新鲜菌柄内侧环割菌柄新鲜菌肉组织并送入抗生素平板培养基上，于20-30℃的温度下培养，待萌发出菌丝后，及时转接。

所述的刀具为手术刀片。

羊肚菌子实体在切割前要基部菌柄完整，用透明胶把羊肚菌整个缠绕密封，中间不留空隙。

所述的抗生素平板培养基为：马铃薯400g，草炭100g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，酵母膏50g，琼脂20g、水1000mL，链霉素30U/mL，青霉素30U/mL，pH6.5。

所述抗生素平板培养基的制作方法为：土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min，过滤取2000mL，加入草炭，小火浸煮20min，过滤取滤液1000mL，在此滤液中加入葡萄糖、酵母膏、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁，小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL，分装于三角瓶，在高温121℃-126℃、高压0.1-0.14MPa灭菌30min。待冷却至50℃左右加入青霉素钠、硫酸链霉素复合抗生素母液，使抗生素终浓度在30U/mL左右，将配好的培养基倒入培养皿中或直接冷却成固体培养基。