[发明专利]一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物学和生物技术领域，涉及了一种植物细胞原位器官再生结合农杆菌侵染的遗传转化方法。

背景技术

植物离体器官再生（organ regeneration）是在细胞全能性的理论基础上建立的，是把植物的器官、组织以至单个细胞，在人工控制的无菌条件下培养，使其生长、分化成完整植株的过程。这种组培技术经过上百年的完善与发展，已实现了上千种植物的培养，在植物无性系的快速繁殖、无病毒种苗培育、新品种的选育、人工种子和种质保存、药用植物和次生物质的工业化生产等方面已广泛应用。

    在植物基因工程研究领域，植物离体器官再生也是一项重要的实验技术。植物基因工程需要将目的基因转化进入植物细胞，这个过程可以通过农杆菌介导法、基因枪法等操作完成，但无论哪一种方法，都主要依靠转化细胞的再生，即组织培养过程获得转基因植株。结合组培的遗传转化途径有很多优点，如重复性较好，基本不受季节限制，适应性较广，转化率较高等。但是这种转化途径也有其局限性，主要是转化细胞的再生受基因型的影响较大，同一物种的某些基因型易于组培，而另外一些基因型很难组培成功。况且有些物种，目前还难于进行组织培养。因此植物再生体系是限制植物遗传转化进一步发展应用的瓶颈。

    解决这一植物遗传转化发展的瓶颈，可以有两个途径。一个途径是进行大量的正交试验，逐一物种摸索组培条件。但由于组培再生涉及培养基的种类、植物生长调节剂的种类和浓度、温度、光照等多种复杂条件，即使是大豆这样重要的经济作物，经过多年的探索仍是世界公认的组培难，因此这个途径短时间内很难有所突破。另一个途径就是开发全新的植物再生体系，使植物再生不再依赖组织培养。

发明内容

为解决上述问题,本发明的目的在于提供一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用,，采用农杆菌原位转化植物，避免了细胞再生的组培过程，应用本方法可以快速建立各种植物的遗传转化体系。

    本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的植物原位再生的方法，其特征是：

A、接穗的获得

选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于25℃光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；

B、嫁接

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口。将用作接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入砧木切口中嫁接；

C、砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

本发明提供的植物原位再生的方法在遗传转化中的应用，特征是：

A、接穗的获得

选取发育饱满无病害的辽园多丽番茄种子，作消毒无菌处理；接种于MS培养基中，于25℃光照培养箱中日光照16h，培养获得无菌苗；

取子叶完全展开、但真叶还未萌发的无菌苗，将子叶、下胚轴切小段作为外植体，置于含有1mg/L 玉米素的MS培养基上，于25℃光照培养箱中诱导愈伤组织；获得新鲜愈伤组织作为接穗；

B、农杆菌的准备

将农杆菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固体培养基上划线培养，28℃培养72小时；在平板上挑取单克隆，接种到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液体YEB培养基，28℃，250rpm培养1-2d直至OD600为0.6；按照1:100的稀释比例将上述少量培养液继续扩繁培养到OD600为0.5；

C、农杆菌侵染

取长有5-10片叶子的健壮辽园多丽番茄或盆栽番茄作为砧木，在砧木顶芽下方横切去头，再垂直向下切口，在伤口上涂抹农杆菌菌液，进行植物侵染；

D、嫁接

将接穗的新鲜愈伤切成楔形，插入侵染过的砧木中嫁接，诱导砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽；

E、转化的砧木原位再生

嫁接后，愈伤组织接穗诱导侵染过的砧木伤口产生愈伤组织并萌发再生芽。

上述农杆菌为EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101或G58，优选EHA105；包含的质粒为PBI121，PBI121的左右边界内含有卡那霉素抗性基因NPTⅡ。