[发明专利]一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学去分化及诱导分化的技术领域，具体涉及利用成体兔的成熟脂肪细胞去分化为多能干细胞继而再分化为心肌样细胞的方法。

背景技术

脂肪组织来源丰富，取材的方法安全便捷，可以作为一种实用的以及有前景的间充质细胞的来源。脂肪组织内含有非脂肪细胞被称为间质血管化组分(stromal-vascular fraction(SVF))。脂肪组织通过机械分离或酶消化(后再经过荧光激活细胞分选术或细胞分选)的方法分离得到SVF.培养的SVF被命名为脂肪来源的间充质干细胞(ASCS/ADSC)。体内外的研究表明人的ADSC细胞能够分化成多种细胞系，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经元细胞、内皮细胞和肝细胞(Schaffler and Buchler，2007，Concise review：Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.Stem Cells 25：818-827.)。但是ADSC细胞只占脂肪组织中极少量的部分并且培养的原代及最初几代的ADSC细胞为异质性的细胞群，可能混杂有内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞(pericytes)等。因此，仍然需要寻找一种来源明确并具有高纯度的细胞系。

成熟的脂肪细胞是脂肪组织中最为丰富的细胞类型。这些成熟的脂肪细胞在体外通过特殊的培养条件可获得一群更原始，并有增殖性的细胞系，称为去分化的脂肪细胞(DFAT)。DFAT细胞可从白色脂肪组织(成熟的脂肪组织)中获取。目前的研究表明，DFAT细胞是一群同质性的细胞类型；DFAT细胞具有丢失脂肪特异性的标识分子，并获得多能性的特性，通过一定的诱导培养方法可以分化为多种间质细胞系，具有成骨、成脂、成软骨、成肌的能力。到目前为止，DFAT细胞已从人、大鼠、小鼠中获取。但是培养的具体方法各异。有研究表明白脂肪细胞与心血管细胞有密切的关系，以及脂肪细胞与内皮细胞有共同的前体细胞。并且，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培养出自发搏动的心肌样细胞(Medet Jumabay，2009，Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes.Cardiovascular Research 85，17-27)。

目前尚无文献报道有关兔的DFAT细胞系的建立以及向心肌样细胞的分化诱导。

发明内容

本发明的目的是从成体兔的成熟脂肪细胞培养兔的去分化的脂肪细胞(DFAT)，并诱导分化为心肌样细胞。

本发明技术方案的关键在于如何简单的方法获取兔的DFAT细胞并诱导成为心肌样细胞。本发明选用的兔是常用的实验动物，在心脏甚至是心的传导束系统中是目前所研究的动物中最多的一种，也是最为典型的动物之一。并且，相对于小鼠来讲，兔是一种较大的哺乳动物，与人的关系更为接近，用兔作为实验对象，用其脂肪组织培养诱导出心肌样细胞，将会是对人的心脏干细胞或者心脏组织工程治疗方面提供有力的支持。

本发明提供了一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法，如图1所示，具体步骤如下：

1、分离出成体兔的白色脂肪组织；

可取成体兔腹股沟处白色脂肪组织(或其他皮下脂肪组织)。将其用0.1M的PBS冲洗，剪成糜状；

2、获得上层白色脂肪部分；

采用酶消化法(参照Ken Yagi DK，Yasushi Okazaki，Koichiro Kano A novel preadipocyte cell line established from mouse adult mature adipocytes.Biochemical and Biophysical Research Communications 2004；321：967-974.)。用胶原酶I，37℃消化40-50min，消化充分；

消化过程也可放在37℃的摇床内。

3、采用天花板法培养后再常规培养；