[发明专利]一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法。

背景技术

葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症为红细胞葡萄糖六磷酸脱氢酶（G6PD）显著缺乏所导致的一组异质性疾病，俗称“蚕豆病”，是一种最常见的遗传性酶缺陷病。葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症（Glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD）是几乎所有高、低等生物重要看家酶之一，分子量为59kDa，其活性形式由2个或4个亚单位组成，每个亚单位含515个氨基酸。该酶催化细胞能量代谢过程磷酸己糖旁路途径的限速步骤，并在此过程中把NADP（辅酶Ⅱ）还原为NADPH，后者为还原型谷胱甘肽合成所必需，是红细胞抗氧化反应中的重要因子。

G6PD酶活性的缺乏直接影响到红细胞的抗氧化能力，可导致溶血性贫血、蚕豆病、新生儿高胆血红素血症等病患，是人类最常见的酶缺陷病，全球范围内约累及4亿人。目前已发现400多种G6PD变异株，由150多种G6PD基因的突变引起，突变的类型和频率呈现明显的地域或群体特异性。此病主要见于非洲、地中海沿岸、中东、亚洲、太平洋诸岛、南美洲等疟疾曾一度流行的热带和亚热带地区，普遍认为与疟疾的抗性选择有关，但一直缺乏足够和必要的直接证据。我国是本病的高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为0.2-44.8%。主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。G6PD缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。

G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。本病临床表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应。因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。60年代在广东兴宁地区在蚕豆收获季节曾爆发G6PD缺乏症的流行，导致许多患者的死亡。G6PD缺乏症又是新生儿病理性黄疸的主要原因。据中山医大的一项统计表明，患G6PD缺乏症的新生儿中，约50%的患儿会出现新生儿黄疸，其中约12%可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。

G6PD缺乏症在无诱因不发病时，与正常人一样，无需特殊处理。防治的关键在于预防，严格遵照健康处方，预防发作。其次是对妊娠晚期孕妇或新生儿服用小剂量苯巴比妥，可有效减低新生儿核黄疸的发生。输血是本病急性发作时最有效的疗法，其次是纠正酸中毒、处理肾衰。轻中度溶血患者一般用补液治疗。

目前，国际上WHO推荐的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PD/6PGD)直接比值法(UVST)是临床实验室确诊G6PD缺乏症的最佳方法。而我国新生儿G6PD缺乏症筛查的普遍使用为荧光斑点和荧光分析法，其中最常用的方法为荧光分析法，该法原理为G-6-P底物在G6PD催化下转变6PG，同时伴随发生NADPH（可发荧光）增加，通过检测NADPH的量来测定葡萄糖6磷酸脱氢酶活性。筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温混合30min可发生上述反应，加入铜溶液使反应终止，用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应物荧光。通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度（U/gHb），G6PD活性低于正常值者为G6PD缺乏。但是荧光分析法对于贫血，溶血，凝血及陈旧的血样标本假阳性率高，准确率低。

现有G6PD／6PGD比值法技术在检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，主要应用于生化仪或者手工测定全血样本中压积红细胞的G6PD和6PGD活性之定量比值。如广州米基公司生产的改良葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒（定量比值法）其原理是：G6PD催化试剂中的葡萄糖六磷酸（6PG）生成六磷酸葡萄糖酸（6PG），伴有还原型辅酶II（NADPH）的生成，NADPH的H在PMS的递氢作用下，将氧化型的NBT（黄色）转变为还原型NBT（蓝色）。蓝色的深浅与NADPH的生成量成正比关系，用分光光度计650nm比色（S1）。作为G6PD的同功酶6PGD，也有将氧化型辅酶II（NADP+）转化成NADPH的作用，同法测得NADPH的量（S2），通过S1/S2的比值得出NADPH的相对含量。