[发明专利]用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。

背景技术

平菇(Pleurotus ostreatus)又名糙皮侧耳，隶属于担子菌亚门(Basidio mycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Homobasidiomy cetidae)，伞菌目(Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)，是目前我国最丰富的真菌种类资源之一。平菇产量高、生长速度，营养丰富，且具有一定的药用功效，再加上可利用的栽培基质丰富多样，使得平菇成为研究食用菌生理生化和遗传的较好的模型。

通过分子生物学技术，根据市场需求及时、定向培育出高质量的新菌株，通过基因工程手段导入外源基因进行食用菌的遗传转化，使其子实体具有相应目的性状，是食用菌产业发展的趋势。另外相对于动植物而言，食用菌分子生物学研究工作起步较晚，同时由于市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资，导致食用菌分子生物学研究滞后。高效安全的食用菌遗传转化体系的建立是从事分子生物学和遗传学研究的基础。平菇高效遗传转化体系的建立，将为其遗传发育机理的研究奠定基础，为其分子育种提供技术支持，为新型生物反应器的研发提供储备，为平菇及其生物活性物质的开发利用提供前提条件，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于平菇遗传转化的重组质粒及其应用。

本发明提供了一种DNA片段，自上游至下游依次包括启动子(平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子)和终止子(平菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因终止子)；所述启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述终止子的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

所述DNA片段还包括抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3所示的hph基因。

所述DNA片段可用于制备转基因平菇。

含有所述DNA片段的重组质粒也属于本发明的保护范围。

所述重组质粒(重组质粒甲)可为在pUC19质粒的多克隆位点间自上游至下游依次插入所述启动子和所述终止子得到的重组质粒。所述重组质粒优选为将pUC19质粒Sph I和Sal I酶切识别序列之间的小片段取代为所述启动子，BamH I和Sac I酶切识别序列之间的小片段取代为所述终止子得到的重组质粒。

本发明还保护在所述重组质粒甲的所述启动子和所述终止子之间插入含有外源基因的DNA片段得到的重组质粒(重组质粒乙)。所述含有外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和抗性筛选基因。所述抗性筛选基因具体可为序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述外源基因具体可为序列表的序列3自5’末端第1-726位核苷酸所示的egfp基因。所述含有外源基因的DNA片段具体可为序列表的序列3所示的DNA片段。

所述重组质粒可用于制备转基因平菇。

用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可为：将所述重组质粒(重组质粒乙)转化平菇的原生质体，培育后得到转基因平菇。所述转化具体可通过PEG/CaCl₂介导实现。

用所述重组质粒制备转基因平菇的方法可包括如下步骤：

(1)用溶壁酶裂解平菇菌丝，得到原生质体；

(2)将所述重组质粒(重组质粒乙)导入所述原生质体，培育后得到转基因平菇。

所述步骤(1)具体可为：将平菇菌丝悬浮于1.5g/100mL的溶壁酶溶液，32℃、60rpm温浴30小时，过滤并收集滤液，然后将所述滤液3000rpm离心10min并收集沉淀，然后将所述沉淀洗涤后悬浮于MMC缓冲液中，即为原生质体溶液。

MMC缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH 5.5)；所述溶质及其在MMC缓冲液中的浓度如下：0.5M甘露醇、5mM CaCl₂。

所述步骤(2)可为：将步骤(1)的原生质体、所述重组质粒、金精三羧酸、亚精胺和肝素在PTC缓冲液中混合均匀，依次进行冰浴和室温静置，离心收集沉淀。

所述步骤(2)具体可为：将70μl步骤(1)得到的原生质体溶液、20μg重组质粒(具体可为10μl 2μg μl^-1的重组质粒溶液)、10μl 20mM金精三羧酸水溶液、5μl 50mM亚精胺水溶液和5μl 20mg/ml肝素水溶液震荡混匀，然后加入50μlPTC缓冲液并震荡混匀，然后冰浴25min，然后加入1ml PTC缓冲液后室温静置20min，3000rpm离心10min，收集沉淀。