[发明专利]一种保护细胞连接的深低温保存方法

权利要求书

1.一种保护细胞连接的深低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、MDCK细胞培养的步骤：

b、将步骤a所得MDCK细胞分配为正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组；

c、将步骤b中的正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、分别做滤器培养；Hsp70高表达组做滤器培养和基因转染，Hsp70+海藻糖组做滤器培养和基因转染；

d、将正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组进行深低温保存；

e、细胞生长及形态学观察(培养细胞显微镜观察、HE染色)；

f、细胞活率测定；

g、细胞连接形态与结构观察与分析；

h、荧光黄实验；

2.根据权利要求1所述保护细胞连接的深低温保存方法，其特征在于，所述步骤a为：

MDCK细胞种植于75cm²细胞培养瓶内，37℃二氧化碳培养箱培养；

培养液：DMEM+10％/胎牛血清；

培养2～3天，当细胞完全汇合时，吸弃培养液，加入2mL消化液消化，显微镜下观察细胞完全脱离瓶壁分离成单个细胞后，吸去消化液，加培养液成细胞悬液，计数细胞密度；

微孔滤器培养：细胞以8×10⁴个/孔(2.5×10⁵个/mL)的密度接种于微孔滤器中，微孔滤器置于24孔板，微孔滤器内外各加入400μL和600μL培养液，隔日换液，3～4天后细胞生长达完全融合，7天后实施步骤b。

3.根据权利要求1所述保护细胞连接的深低温保存方法，其特征在于，步骤c中的Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组的提高Hsp70高表达的方法：

热刺激诱导

将微孔滤器培养融合的细胞置于42℃水浴箱孵育30分钟，重新放回37℃二氧化碳培养箱恢复正常培养，分别继续培养12、24和48小时后测定细胞Hsp70表达水平，确定Hsp70高表达的时间；然后，采用上述热刺激诱导方法诱导Hsp70高表达细胞并进行深低温保存，复温后进行实验观察与检测；

具体为：

或者，谷氨酰胺(Gln)静脉注0.75g·kg^-1，6小时后取血管(n＝8)；

或者，加热处理(热休克)TEB样本培养皿置于加热板上，并加温到41℃，分别保持15min，回复37℃条件继续培养120min，进行各项实验。

或者，HSP诱导剂(谷氨酸盐)(参考：H.J.Jang等，2008年)：TEB培养皿中加入终浓度10mmol/L谷氨酸盐培养12h，然后回复正常培养12小时后，进行各项实验；

接着，构建高表达Hsp70MDCK细胞系

Hsp70目的基因的重组载体pLenti-Hsp70的构建，提取HepG2肝癌细胞株基因组总DNA→设计引物、酶切并PCR扩增Hsp70片段→酶切、鉴定、克隆，构建pLenti-Hsp70质粒→pLenti-Hsp70经酶切及测序鉴定；

病毒的包装

制备重组病毒质粒和辅助包装原件载体质粒(pVpack VSV-G与psPAX2)→无内毒素抽提→共转染293T细胞(按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行)→收集细胞上清液，浓缩后的慢病毒浓缩液保存于-70℃备用。病毒经有限稀释后感染293T细胞，通过绿色荧光蛋白的表达标定病毒滴度；

Hsp70细胞株筛选

细胞接种到6孔细胞培养板(DMEM：不含抗生素、10％胎牛血清)→添加病毒液到细胞→24小时后换液处理；感染48小时荧光显微镜检查GFP表达；96小时开始对细胞进行换液处理，并添加浓度为500mg/L的G418进行筛选→逐步放大培养(24孔、6孔、60mm和100mm培养皿)→反复传代，Real time PCR和Western blotting检测MDCK细胞Hsp70稳转细胞的Hsp70表达情况；

深低温保存

Hsp70稳定高表达的MDCK细胞种植到微孔滤器，按步骤a细胞培养条件培养，并进行深低温保存。