[发明专利]硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨支架材料的制备方法，特别是一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法。

背景技术

自然骨是由纳米羟基磷灰石(HA)为主的无机相与胶原蛋白(Col)为主的有机相有序组合的复合材料。从仿生角度出发，制备胶原蛋白(Col)与纳米羟基磷灰石(HA)复合的多孔骨支架，在骨组织工程领域具有重要的应用价值，成为研究的热点。

胶原蛋白作为一种天然生物材料，其本身是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的主要成份之一，具有较多的作为组织工程支架材料的优点，如低抗原性、止血作用和促进细胞增殖的作用等，但降解过快和强度较差的缺点又一定程度的限制了它的应用。近年来，有学者开始致力于模拟细胞外基质的研究，已经构建了诸如胶原蛋白-硫酸软骨素等支架材料，这些复合材料克服了单纯胶原蛋白的缺点，显著提高了其机械强度和改善了降解率过快的问题。其中硫酸软骨素(CS)主要存在于软骨和关节骨中，是软骨和关节骨的细胞外基质的重要成分。单纯的CS具有抗炎、促进新陈代谢、加速伤口愈合的作用；CS作为大分子聚阴离子物质，在一定浓度下具有高度粘弹性，可聚集在病变组织周围而使其免受氧自由基的侵袭，起到保护作用；CS的降解产物不仅没有毒性，反而具有排毒的作用，且可以成为新生组织的原料。所以CS的众多优点使其作为组织工程支架材料有广阔的前景。基于以上思路，通过构建硫酸软骨素交联的Col/HA支架材料，提高Col/HA支架材料的强度和生物相容性，在组成上更加接近自然软骨和关节骨，推进骨组织工程的发展。

近年来，制备硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架的工艺已经有所报道。如：中国专利号ZL 03144308.7，授权公告号CN1255478C，公开了一种“复合骨组织工程支架材料及其制备方法”，首先制备了Col/HA的支架，再通过将硫酸软骨素制备成交联液，直接交联在Col/HA支架上，该过程工艺繁杂，并且只提到了生物相容性的提高，而没有提到CS的交联对Col/HA支架的强度的提高作用；中国专利授权公告号CN101020082 B，公开了 “一种骨修复材料及其制备方法和通途”，通过将不同粒径的煅烧骨粉与硫酸软骨素在乙酸或NaHCO3中溶解共混，得到骨修复材料，该技术存在涉及的支架材料孔隙率不可控、化学稳定性差、力学强度低的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术交联方式繁杂，化学稳定性差，对支架强度提高不明显的不足的缺陷，提供一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的制备工艺包括以下步骤：

一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

(1)     将胶原蛋白Col溶于醋酸溶液中，4℃下配制成浓度为：1%～1.5%g/L的Col溶液，并调节pH值至中性；用超纯水溶解硫酸软骨素CS制成浓度为：1%～1.5%g/L的CS溶液；

(2)     按Col溶液与CS溶液的体积比为5:1～9:1的比例，在4℃搅拌下，将CS溶液缓慢滴加到Col溶液中；

(3)     向步骤(2)得到的溶液中加入可溶性钙盐溶液和磷酸盐溶液，其中钙磷的计量比为1.67：1，并控制Co与羟基磷灰石的质量比为1:9～3:7，缓慢加热到40℃，并搅拌20分钟；调节pH值为7，出现白色悬浊液，持续搅拌24小时；

(4)     将步骤(3)所得的沉淀物清洗并离心，干燥，得到硫酸软骨素-胶原蛋白/羟基磷灰石粉末；

(5)     将步骤(4)得到粉末和羧甲基纤维素按100:0.2～2的质量比与双氧水溶液进行调和至粘稠状后搅拌30分钟发泡，得到浆料；

(6)     将步骤(5)所得到的浆料快速移入12孔细胞培养平板，并立即放入-20 ℃ 冰箱预冷冻24h；取出，于-50 ℃ 冷冻干燥，得到硫酸软骨素-胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架材料；

(7)     将步骤(6)所得到的多孔支架浸泡于50mmol/L的2-吗啉乙烷磺酸0MES的40%乙醇溶液30min；取出，再浸泡于50mmol/L的 2-吗啉乙烷磺酸MES、20mmol/L的碳化二亚胺 EDC、5mmol/L 的琥珀酰胺NHS的40%乙醇溶液24h；得到交联材料；