[发明专利]酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法

权利要求书

1.酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法，其基于三电极系统，该方法包括以下步骤：

a).有序介孔碳材料的制备

取1-5g直径为5-50nm的纳米硅球(SiO₂)，随后向SiO₂中加入3mL0.024g mL^-1的Ni(NO₃)₂·6H₂O的乙醇水溶液(V_乙醇∶V_水＝1∶1)；浸渍过Ni(NO₃)₂·6H₂O的SiO₂在烘箱中干燥，然后将干燥后的SiO₂在压片机上压成薄片；

向10mL苯乙烯单体中加入150μL浓硫酸(质量浓度98％)酸化处理10-30分钟；将10mL酸化后的苯乙烯滴加到1-5g浸渍过Ni(NO₃)₂·6H₂O的SiO₂薄片上，120-200℃下反应，然后将苯乙烯和SiO₂的复合物移入管式炉中，在高纯惰性气体(氮气或氩气等气体)保护下升温至750-950℃热解2-5h；将热解产物加入质量浓度为15-30％HF溶液中搅拌去除SiO₂模板，过滤得到孔径为5-50nm的介孔碳；

b).有序介孔碳的表面改性和功能化

将0.2-0.8mg介孔碳材料加入到1mL 0.56mg mL^-1亲水性离子液体中超声振荡；利用含咪唑阳离子的亲水离子液体与介孔碳之间固有的强相互作用，使离子液体在介孔碳表面形成近单层或多层修饰，可以获得亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料；

c).酶生物传感器的构建

在亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料溶液中加入等体积的2.5-20mg mL^-1的酶溶液，4℃低温振荡0.5-3小时，通过介孔材料的虹吸作用将酶分子诱陷到介孔碳的介孔中形成超分子自组装体，然后取3-10μL的超分子自组装体溶液滴加到电极表面，得到酶修饰电极；

d).将c)中所述的酶修饰电极作为工作电极放入空白检测溶液(50mmolL^-1磷酸缓冲液)中，进行电化学扫描并记录响应信号I_a，将酚类化合物作为目标分析物加入到空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号I_b；

随着加入酚类目标物浓度的升高，酶生物传感器产生的电流信号逐渐增强，并且在0.5-10μmol L^-1范围内线性相关；以酚类目标分析物浓度(c)为横坐标，其对应产生的电流信号强度(I_b-I_a)为纵坐标，绘制出酚类目标物浓度与电流信号强度的线性相关曲线；

e).将含有酚类化合物的检测样品加入到c)中所述的酶修饰电极的空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号I_b，并将其产生的电流上升量(I_b-I_a)带入线性相关曲线中就可以评估出检测样品中酚类化合物的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所采用的电化学装置的参比电极为银/氯化银电极，对电极为铂丝电极，工作电极是玻碳电极、金电极、铂电极或碳糊电极，优选玻碳电极。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶为反应底物为酚类化合物的酶，为酪氨酸酶或漆酶，优选酪氨酸酶；

步骤1.d)所述的目标分析物酚类化合物包括儿茶酚、苯酚、壬基酚和双酚A中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

5-50nm直径的纳米硅球的制备过程：将0.2mmoL赖氨酸和4mL正硅酸乙酯加入30mL水溶液中，在50-90℃温度范围内磁力搅拌反应；反应完成后，80-100℃缓慢蒸干溶剂，即得到5-50nm直径的纳米硅球。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述的介孔碳孔径大小为550nm，优选10nm。