[发明专利]一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因载体材料，具体地说，是一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法，基因治疗有三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等问题，因此，非病毒载体近年来发展迅速，尤其是阳离子聚合物。

聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而，小分子PEI虽细胞毒性低，但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离，造成转染效果差；分子量在20kd以上的PEI虽具有较理想转染效率，但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性，致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。因此，如何将PEI改造成转染效率高、细胞毒性低的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。

中国专利文献CN100462135C公开了聚乙烯亚胺衍生物纳米中空微球及其制备方法。中国专利文献CN100536924C公开了一种用聚乙烯亚胺修饰壳聚糖制备基因给药载体的方法，是以壳聚糖为骨架，用孵育法同DNA结合得到壳聚糖纳米粒溶液，配制不同N/P的壳聚糖溶液，将PEI溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液，孵育后制得。但是关于一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物。

本发明的再一的目的是，提供一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物，所述的衍生物中两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比是1:1-20，所述的衍生物的制备原料中聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000，所述的衍生物的制备原料中壳聚糖的分子量范围为1000-50000。

所述的衍生物中两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比是1:1-10，所述的衍生物的制备原料中聚乙烯亚胺的分子量范围为600-30000，所述的衍生物的制备原料中壳聚糖的分子量范围为1000-30000。

所述的衍生物是由以下制备方法制备得到：

a、两亲性壳聚糖的制备：壳聚糖和正辛醛或正癸醛或月桂醛，加入到甲醇中，搅拌后分批加入KBH₄，搅拌过夜，滤过，用水和热甲醇反复洗涤滤饼，真空干燥；取上述产物置于三颈瓶中，依次加入N-甲基吡咯烷酮、KI、15%NaOH水溶液和CH₃I，充分搅拌下升温至60℃反应1 h，冷却至室温，离心，收集下层固体溶于蒸馏水中，透析5d，滤去不溶物后将滤液冷冻干燥，得两亲性壳聚糖；

b、以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物的制备：称取除水后的两亲性壳聚糖，按摩尔比1:1-20加入三光气 ，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中，室温下磁力搅拌反应过夜；真空旋蒸除去溶剂，再用无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解，然后加入与三光气等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下，将无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应；待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于乙酸乙酯中，高速离心后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，即得活化的两亲性壳聚糖；取与三光气等摩尔量的PEI除水后溶于无水乙醇中，双活化后的两亲性壳聚糖溶于无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，高速离心后取上清，旋转蒸发，用水溶解后透析2d，冻干，即得所述的以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种以两亲性壳聚糖为交联剂的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，所述的衍生物的制备方法包括以下步骤：