[发明专利]快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制法

说明书

技术领域

本发明属于临床微生物快速检测的免疫层析技术领域，特别是涉及一种利用抗ESAT-6蛋白抗体相关的免疫层析显色来早期鉴定培养物中结核分枝杆菌的方法。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球已有近1/3的人口感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80％，其中约5％-10％携带者可发展为活动性结核病。我国结核病人数居全球第二位，每年死于结核病的人是各类传染病死亡人数总和的两倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的结核分枝杆菌携带者发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，更是影响我国发展的重大社会和经济问题。提高结核病及HIV合并结核感染的早期准确诊断水平，发展一种适合我国国情的快速、灵敏便宜的结核分枝杆菌早期检出方法刻不容缓。

结核分枝杆菌培养分离是目前结核病诊断的金标准，但细菌的遗传特性决定了其生长周期特别长，使用普通罗氏培养基需要4-8周时间，改良酸性罗-琼氏培养平均也需要25天，无法充分满足临床快速诊断的需要。针对结核分枝杆菌的快速培养，目前出现了各种改良的液体培养基和自动培养系统(马俊，王自立.结核分枝杆菌快速培养的研究进展及其临床意义[J]中国脊柱脊髓杂志，2007，17(5).388-390)。液体变色培养基最先由德国Heipha/Biotest公司研制，称为MB Redox系统，目前国内也有类似产品的研发。自动培养系统包括以Bactec MGIT 960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统以及BBLMGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统等。不管是液体培养基还是自动培养系统，都还存在污染率高的问题，对于仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定阳性，费事费力。自动培养系统更由于仪器和试剂价格昂贵，难以得到普及。因此研究开发新一代结核分枝杆菌的快速检测试剂非常必要。

结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白。它具有良好的免疫原性，且仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而不存在于BCG及其他非致病性分枝杆菌(Harboe M.Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG[J].Infection and Immunity，1996，64(1)：16-22.)，因此在诊断结核杆菌感染的过程中可以区别是结核分枝杆菌感染还是非致病性结核分支杆菌感染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用简便快捷、灵敏度和特异性高、适合于基层现场快速检测培养物中结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，包括上样垫、含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜、吸样垫以及支撑板；检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜的上表面分别设置胶体金垫和吸样垫，上样垫位于胶体金垫的上表面，硝酸纤维素膜的下表面与支撑板固定相连。

本发明还同时提供了上述快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

A、抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3和TBEA8的制备：

用于包被检测线的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，其能特异性识别ESAT-6的aa 1-14MTEQQWNFAGIEAA抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201080；

用于胶体金垫中金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，其能特异性识别ESAT-6的aa 24-36 SIHSLLDEGKQSL抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201081；

制备方法如下：