[发明专利]一种蓟柄锈菌的离体保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种蓟柄锈菌的离体保存方法。

背景技术：

锈菌，菌丝有隔膜，初生菌丝单核，随后双核化，生长在寄主的细胞间隙，以吸器侵入细胞。吸器一般围绕着细胞核与细胞质紧密地结合在一起。锈菌的细胞质中含有核微粒、线粒体、肉质网、糖元颗粒和类脂体。菌丝隔膜的结构与高等担子菌不同，而与子囊菌近似，向心生长，上下各有1层电子密集层，中间为1层电子稀薄层，从四周向中心逐渐变薄。中央有被填充物填塞的孔，上下无盖状结构。锈菌不生子实体，只生孢子器和孢子。最典型的锈菌有5类孢子，即性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子，其中夏孢子在生长季节中可连续产生多次，是多数植物锈病的主要孢子形态，在植物锈病的发生中起主导作用。锈菌易引发植物发生锈病，锈菌在自然条件下只能在活的寄主植物体上生长，寄主植物被锈病菌侵染后，在叶片、叶鞘或茎等植物器官组织上长出铁锈状的孢子堆。锈病是流行性很强的植物病害。

2006年我们在山东青岛地区发现了染锈菌的杂草小蓟植株，患病植株轻者矮化，或不能正常开花结籽，重者死亡。病叶背面长满了锈色的孢子粉。申请人对小蓟植株的锈菌进行了鉴定，发现其属于担子菌亚门，冬孢菌纲，锈菌目，柄锈菌科，柄锈菌属，蓟柄锈菌(Puccinia obtegens )。夏孢子近圆形，黄褐色至褐色，直径为26-27.5μm，有微细小刺。冬孢子短椭圆形，双细胞大小为32-39×21-27μm，褐色有微细小疣，横隔处不缢所，柄很短，无色透明。申请人对该锈菌进行了详细地研究，以期为杂草小蓟的生物防治开辟新的资源。并且，以此锈菌作为杂草小蓟生物防治的新菌源。

长期以来，杂草防除问题对农业生产提出了严峻的挑战。McWhorter等和Parker等统计结果表明，由杂草造成的全球农作物平均产量损失大约为12％。20世纪50年代除草剂的销量只占整个农业化学剂总销量的20％，而20世纪80年代上升为50％，此后上升为60％。化学除草剂的大量应用，已明显暴露出诸多弊端，首先是除草剂雾滴飘移，药液挥发，选择性不理想，降解产物危害作物，甚至造成作物药害；其次是反复使用除草剂造成耐药杂草种群的上升、抗除草剂杂草的出现和对环境污染的加重。由此可见，寻求更为安全有效的除草剂已成为除草剂产业今后的发展方向。生物除草剂有利于环境保护，并对杂草防除有效。尤其是植物病原物除草剂越来越突现出优点，在一定程度上激发人们对其产生浓厚的兴趣。小蓟又称刺儿菜[Cephalanoplos segetum(Bunge)Kitam.]，是我国农田(包括烟田)的主要杂草之一，发生十分广泛。小蓟与其它农田杂草一样与作物竞争水、肥和空间，直接影响作物的产量和质量。目前农田杂草的防除主要依靠人工除草和化学除草剂防除，大量化学农药的使用也是无公害烟叶生产的主要障碍。为此，针对小蓟病原锈菌进行研究，以期为小蓟等杂草的生物防治开辟新的途径。

通常锈菌只能在活体植株上保存，即，锈菌不能在人工培养基上培养。因此，迫切需要研制一种保存简单，操作方便，夏孢子萌发率高，并能够达到研制生防制剂目的离体保存方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，发明一种新的保存简单，操作方便，夏孢子萌发率高，并能够达到研制生防制剂目的蓟柄锈菌离体保存方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种蓟柄锈菌离体保存方法，其中，按照下述步骤操作：

a、制备夏孢子粉，

b、取一种固体颗粒，并在其表面喷洒一层1％羧甲基纤维素钠水溶液，然后滚上一层夏孢子粉，

c、A粉包衣10～15层，形成以固体颗粒为核心的颗粒，

d、B粉包衣次外层，

e、滑石粉包衣最外层，

f、晾干并贮藏。

步骤a为：从田间人工采集感染了蓟柄锈菌的小蓟植株，然后在室内进行单孢纯化，人工接种小蓟，使小蓟感染蓟柄锈菌。然后用手术刀从发病的小蓟叶片上刮取成熟的夏孢子，将刮取的夏孢子与其3～5倍重量分数的A粉混合制成夏孢子粉。

步骤b为：用天平称取与夏孢子粉等重量的固体颗粒，然后在颗粒表面喷洒质量分数比为1％羧甲基纤维素钠水溶液，充分搅拌使羧甲基纤维素钠水溶液均匀地分布在颗粒表面；

将颗粒与夏孢子粉混合，并滚动颗粒，直至所有的夏孢子粉全部均匀滚粘在颗粒的表面。

步骤c为：再次在颗粒表面喷洒质量分数比为1％羧甲基纤维素钠水溶液，喷后在颗粒表面再滚粘上A粉1层；