[发明专利]表位肽

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫学领域，特别涉及一种B细胞表位肽及其应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)定义：由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。该病在临床上的主要病征为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。2型糖尿病：以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足，至以胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗(WHO1999标准)。

2型糖尿病的致死率的预测一直是一个难题。第47届欧洲糖尿病研究学会年会(EASD2011)上报告的荷兰一项针对2型糖尿病患者初级保健的前瞻性观察研究表明，循环过氧化物氧化还原酶4(peroxiredoxin-4，Prx4)水平的增加与2型糖尿病患者的心血管和全因死亡率独立相关。但是，目前临床上还不存在一种基于Prx4的糖尿病检测试剂。

发明内容

本发明旨在提供一种B细胞表位肽及其蛋白载体，其能过氧化物氧化还原酶4单克隆抗体的特异性抗原。

实现上述目的的技术方案为：

表位肽，所述表位肽源自原人过氧化物还原酶4的第14-26位，或来源于人过氧化物还原酶4的第20-32位，或来源于人过氧化物还原酶4的26-36位，或来源于人过氧化物还原酶4的1-19位，所述人过氧化物还原酶4的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2-5中的任一种。

所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6-9中的任一种。

所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：10-35中的任一种。

含有所述表位肽的蛋白载体，所述表位肽与BSA、OVA、肌红蛋白、KLH和破伤风类毒素任一种蛋白载体连接，得含有所述表位肽的蛋白载体。

本发明的另一目的在于提供表位肽单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可作为检测过氧化物还原酶4的特异性诊断试剂，其应用为类风湿关节炎的诊断及2型糖尿病的预测提供了新方法。

实现上述目的的技术方案为：

所述表位肽的特异性单克隆抗体。

所述的特异性单克隆抗体在制备诊断二型糖尿病诊断试剂中的应用。

所述的特异性单克隆抗体在制备检测类风湿关节试剂中的应用。

所述的表位肽在制备诊断二型糖尿病诊断试剂中的应用。

所述的表位肽在制备类风湿关节炎抗原中的应用。

有益效果

1.抗Prx4单克隆抗体的制备：通过生物信息学分析，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，预测过氧化物还原酶区IV中的潜在B细胞表位，发现新的B细胞表位区域，人工合成上述34段表位肽，与BSA交联后通过新型免疫程免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗Prx4单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后对杂交瘤细胞核型分析，明确染色体数目，证实杂交瘤确实是小鼠脾细胞和SP2/0融合而成，再进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对Prx4的。

2.Prx4重组蛋白的制备：从GENBANK中获得人Prx4编码序列，通过密码子偏性改造，同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列，进行Prx4全长基因的合成制备；将Prx4基因与载体连接，获得Prx4重组质粒；将Prx4重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得Prx4重组蛋白；鉴定重组蛋白的可溶性后纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到了高纯度的Prx4重组蛋白，可以用于筛选抗Prx4杂交瘤细胞。

3.制备抗Prx4特异性兔多克隆抗体：用从血清中分离纯化得到的Prx4免疫新西兰大白兔，经过多次免疫，待兔血清中的抗Prx4抗体达到较高效价后放血，经过抗原亲和层析纯化后得到了高效价、高亲和力的特异性的多克隆抗体。

4.建立了ELISA检测体系：应用实施例2制备的单克隆抗体(单抗2-35)分别为捕获抗体，实施例1制备的多克隆抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，针对上述B细胞表位肽的单克隆抗体可作为单独作为捕获抗体。

具体实施方式

实施例1多克隆抗体的制备

一重组蛋白

1编码Prx基因成熟肽cDNA的克隆和验证