[发明专利]一种改良保存菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种液体菌种的保存方法。

背景技术

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以菌种保藏方法虽多，都是根据这三个因素而设计的。保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养保藏法

　　又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），

培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4．寄主保藏法

　　用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法

　　先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

对于试验室来说，经常采用的是冷冻保存法，但是目前一般只加入一定比例的甘油或二甲基叶枫作为保护剂，混合菌液后直接放入-20℃冰箱。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、保存时间长的液体菌种的保存方法。

本发明所提供的液体菌种的保存方法是将菌种与甘油、二甲基亚砜以合适比例混合，放进小泡沫盒里，再放入-20℃冰箱冻存。

甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃——-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃——-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。

DMSO作用跟甘油类似，也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，但效果比甘油好，0.5mol/L左右的二甲基亚砜可以透过细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞。主要是因为加入后可以使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内的水分透出，减少了冰晶的形成，从而避免细胞的损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。DMSO比甘油相比，另一个优点就是不粘稠。

具体实施方式

本发明中详细的保种步骤如下：

1、取一定浓度的甘油和二甲基亚砜作为防冻剂，高压灭菌；

2、加入适量菌液，混匀；

3、放入泡沫盒，-20℃冰箱冻存。

下面结合具体实例进一步说明本发明。

实施例1

1、制备保护剂，甘油浓度30%，二甲基亚砜浓度为15%，高压灭菌；

2、吸取0.5ml保护剂于冻存管内，再加入0.5ml菌液，使得甘油的终浓度为15%，二甲基亚砜的终浓度为7.5%；

3、混匀，放入小泡沫盒，于-20℃冰箱冻存。

上述保存方法保存的菌种，于-20℃冻存一年半以后，接种培养基，经37℃培养18h，能长出菌落。