[发明专利]一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用

说明书

分案说明 

本案是申请号为201010507298.7，申请日为2010年10月14日，名称为一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用的中国发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种能抑制JEV复制与感染的shRNA及其应用。 

背景技术

乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒病毒性疾病。该病对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，广泛分布于亚洲，特别是远东一些国家和地区。近年来其流行分布范围不断扩大，流行频率也不断增强。 

乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属。病毒粒子呈20面体对称，在核酸外面包有致密的脂蛋白囊膜。JEV基因组为单股正链RNA分子，本身具有传染性。其基因组编码产物为3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。 

乙脑属于自然疫源性疾病，蚊虫是该病的主要传播媒介。本病的发生与气候环境有着密切的关系，呈明显的季节性。我国一般流行高峰在7、8、9三个月。多种动物均可感染本病，感染后成为传染源。经检查发现，在流行病区，畜禽的隐性感染率均很高，特别是猪，其次是马和牛。病毒在感染动物血液内存留时间很短，主要存在于中枢神经系统及肿胀的睾丸内，但猪感染后病毒血症期维持时间长，血液中病毒滴度高，对乙脑的传播起重要作用。同时，猪是乙脑传播给人类最重要的宿主，一般情况下JEV的感染呈猪-蚊-人链状。猪感染乙脑时间的早晚和感染率的高低与人乙脑的流行密切相关。感染后，人、猴、马和驴出现明显的脑炎临诊症状，病死率较高。猪群不发生脑炎症状，怀孕母猪可表现高热、流产、死胎和木乃伊胎，死产胎儿出现脑缺损症状，公猪则出现睾丸炎，给养猪业发展带来巨大的损失。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象。RNA干扰现象最初在植物和低等生物中被发现，随着研究的深入，近来在高等的真核生物中也被发现，并且证明是一种重要的进化保守现象。已证明短的双股干扰RNA(siRNA)是由dsRNA特异的核酸内切酶，Dicer酶，剪切而来。RNA诱导沉默复合物(RISC)是由siRNA和一种多酶复合物结合构成，它位于mRNA特定的部位，并且发挥核酸内切酶和外切酶的活性来作用mRNA。除了在转录水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被证明通过DNA甲 基化沉默启动子而降低蛋白表达。短发卡RNA(shRNA)通常利用载体导入细胞，并且可被传递到子代细胞中去，从而使基因沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后按上述机制达到降解mRNA的目的。它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显示出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都发现RNAi对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的，更有效的途径。毫无疑问，随着对RNAi机制的深入了解以及技术的进一步完善，RNAi技术必将为生命科学研究和临床疾病的防治带来新的革命。 

乙型脑炎的流行是世界性的公共卫生问题之一。目前对于乙脑尚无特效治疗手段，因此预防乙脑的发生尤为重要。而传统的疫苗生产不能满足人类日益发展的需要，因而，科研人员不断地寻求新的治疗方式。RNAi这项新兴技术即是其中颇有潜力的新途径。目前，国内外运用RNAi治疗乙脑还处在科研院所的理论研究中，并未大规模地投入到临床治疗中，但其研究结果显示出卓越的抑制病毒复制与感染的能力，在临床治疗中有着极大的潜力与良好的前景。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能快速、特异和显著抑制JEV在动物细胞与个体中复制和感染的shRNA及其应用。 

本发明的另一目的是提供含有该shRNA的真核表达质粒及其应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现：