[发明专利]一种拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的克隆方法。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。目前，组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段，该类启动子除具有基本结构外，通常还有一些调控特异表达的序列，这些序列为转录因子提供了结合位点，通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达通常只发生在特定的组织或器官，并往往表现出发育调节的特性。

根是植物吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因PHT1启动子与GUS融合，在农杆菌介导下转化拟南芥和拟南芥，组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和拟南芥的根毛及根表皮表达，说明该启动子是根特异的。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白基因(calreticulin)构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明，根细胞不仅能高效产生某些目的蛋白质，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。

植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用，根系吸水力的提升和根系形态的建成，无疑对提高植物的吸水力，增强其抗旱性具有重要的意义。多数的植物功能基因如激素合成、代谢相关基因，植物生长、发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达，通过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达，不能特异性的实现对植物根系功能和发育的调控。

为了解决上述问题，需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动相关功能基因的表达，以达到既能提高植物吸水性、增加植物根系长度和数量，又不影响植物地上部生长、不损害植物营养生长的目的，由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研究中需要克隆得到根特异性表达基因启动子。 

发明内容

本发明提供一种拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的克隆方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤：

Ⅰ、获取拟南芥根特异性基因ARSK1：

A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；

B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因ARSK1；

Ⅱ、获取拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子：

A、在线分析得到拟南芥根特异性表达基因ARSK1的启动子，再在拟南芥根DNA中进行克隆得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子。

步骤Ⅰ-B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为：AT1G79580.1、AT1G62980.1、AT1G66470.1、AT1G27740.1、AT1G54970.1、AT3G10710.1、AT1G12560.1、AT2G26420.1、AT1G12040.1、AT1G62440.1、AT3G62680.1、AT2G26290.1。

所述的拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的序列为SEQ ID No：1。

在步骤Ⅱ之后，进行所述的拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子功能验证，包括以下步骤：

A、在线分析得到所述的拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；

B. 将所述的拟南芥根特异性表达基因ARSK1启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到ARSK1启动子缺失体片段；

C. 将所述的ARSK1启动子缺失体片段分别构建ARSK1启动子缺失体GUS表达载体；

D、将所述的ARSK1启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。

所述的ARSK1启动子缺失体片段的大小分别为1981bp， 1460bp， 879bp， 762bp， 409bp，358 bp；

本发明的有益效果为：