[发明专利]一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及法医学检验领域，具体地说，涉及一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法。

背景技术

水中腐败尸体的溺死诊断是法医学领域中最大的难题之一，硅藻检验一直以来被公认为最佳方法。目前，文献报道的硅藻检验方法有很多，如强酸消解法、灰化法、Soluene – 350消解法、硅胶梯度离心法、酶消解法和PCR法等。

与其它检验方法相比，强酸消解法具有组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低等优点，因而在法医学实践中应用最为普遍。如GA/T 813—2008标准（《人体组织器官中硅藻硝酸破机法检验》）中，利用浓硝酸和无水乙醇（或乙醚），在电炉加热条件使组织器官消解，消解充分后，将消化液倒入离心管经反复离心后制片；最后采用光镜观察法，以10倍或40倍物镜检查硅藻。

然而目前的强酸消解法存在的不足表现为：一、消解过程剧烈，存在强酸喷出灼伤人体的危险，且对硅藻产生一定程度的破坏，导致硅藻损失；二、组织需求量和酸消耗量大，大量的强酸与法医学实践中的腐败检材在消解过程中释放出二氧化氮和恶臭气体，不仅污染环境而且导致检验工作条件恶劣；三、组织消解时间长，工作效率低；四、消解不彻底，存在部分组织残渣、油脂等，影响后续硅藻检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测灵敏度高、能有效避免污染、定性定量分析准确，改善工作环境、降低劳动强度的法医学硅藻检验方法。

为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于混合酸消解的法医学硅藻检验方法，包括光学显微镜检验和扫描电镜检验两方面，其特征在于包括以下步骤：

所述光学显微镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过光学显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品（肺、肝、肾、骨髓等脏器组织及现场水样）置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）离心处理

将消解液倒入离心管中，以重蒸水平衡，离心，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后离心，重复该步骤，直至上清液pH值约为中性。

（4）涂片

吸去离心后的上清液，取沉淀物1-2滴，尽量薄且均匀地涂布在载玻片上，烘干。换载玻片，重复该步骤，直至所有沉淀物涂片完毕；盖上盖玻片，以环氧树脂封闭，以备镜检。

（5）镜检

在光学显微镜下搜寻硅藻，记录所有涂片上的硅藻数及硅藻种类。

所述扫描电镜检验包括如下步骤：

（1）空白试验

通过扫描电子显微镜检验，确认所有试剂、工具、器皿不含硅藻。

（2）混合酸消解

于通风橱内，取待检验样品（肺、肝、肾、骨髓等脏器组织及现场水样）置一次性塑料试管内，依次加入浓硝酸、浓盐酸和过氧化氢溶液，静置后以水浴加热方式消解；

（3）真空抽滤

采用单联或多联真空抽滤装置，对消解液进行真空抽滤，消解液抽滤完后加超纯水继续抽滤，使滤膜表面接近中性，最后加无水乙醇抽滤以去除滤膜水分；

（4）扫描电镜自动拍照并存储图像

在真空镀膜仪或离子溅射仪中将滤膜表面镀上金膜或铂膜，使其具有导电性，然后在扫描电镜一定放大倍数下，将滤膜含样品区域化分成若干个相同大小、紧密相邻的视场，对每个视场进行自动拍照并存储其图像；

（5）硅藻定性定量分析

采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图片中的硅藻进行检查、分类和统计处理。

在上述检验方法中，本发明混合酸消解步骤具体为：所述待检验样品为1-10g肺组织、1-10g肝、1-10g肾组织、1-10g骨髓或1-10ml的现场水样；取待检验样品置一次性塑料试管内，依次加入5-20ml浓硝酸和2-6ml的浓盐酸，使浓硝酸的体积为浓盐酸的2-6倍；静置2-5min后，用塑料滴管以1-3滴/10s的速度滴加30%过氧化氢，静置10-20min，再将样品放置水浴锅内，60-95℃条件下恒温水浴30min-90min；上述所使用的酸均为分析级。

法医学硅藻检验中，既要将组织消解彻底，又不能对硅藻形态造成大的破坏，因此必须选择合适的消解体系和反应条件，本发明的混和酸消解体系和反应条件的选择和确定针对法医学硅藻检验的特点设计，实验证明，所采用的消解体系和反应条件可有效地将有机物质消解彻底，且不会对硅藻结构造成明显的破坏。