[发明专利]玉米逆境诱导型启动子的克隆及活性分析

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温、干旱和盐害逆境胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体来说，本发明涉及一种来源于玉米脂氧合酶(lipoxygenase)基因(ZmLOX10)，并在植物中高度表达的多重逆境诱导型启动子序列。

背景技术

在全球气候变化加剧，资源环境压力增大，金融危机影响加重，粮食供给下行趋势不断深化的背景下，保障我国粮食安全始终是一项紧迫而重要的战略任务。逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。每年直接由盐碱、干旱、低温等逆境胁迫造成的农作物减产超过总产的20％左右。

玉米是我国三大粮食品种之一，种植面积和产量均居世界前列，对保障国家粮食安全，提高主要农产品供给能力非常重要。玉米属于逆境敏感型植物，生育期内极易受低温、干旱、盐渍等多元逆境胁迫的干扰和伤害。解决玉米生产中严重的多元逆境胁迫问题，提高玉米产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。虽然已有许多基因工程方法培育出抗性品种，但存在明显的缺陷，即：在基因工程中，用来控制目的基因表达的启动子主要以CaMV35S、玉米Ubiquitin等组成型表达启动子为主。该启动子虽能使目的基因过量表达，但它是无环境、组织和时间特异性的组成型表达的启动子。利用组成型表达启动子控制抗性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但正常环境条件下细胞内也会过量表达抗逆蛋白，对植物来说是一种能量浪费，而且正常环境下细胞内的抗逆蛋白长时间过量的积累可能妨碍植物的正常生长代谢，引起植物的形态发生改变，造成转基因植物生长发育严重停滞甚至死亡。因此，利用逆境诱导型启动子实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控抗逆基因在改良作物的抗性中成为当前研究的热点。

非生物胁迫，如干旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。国内外有一些关于逆境启动子的报道，rd29A启动子是胁迫诱导型启动子，受ABA、干旱、高盐及低温等逆境诱导，是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子(李新玲等，2007；杨春霞等，2008；吴梅花等，2005；Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1993)。Yamaguchi-Shinozaki等(2001)分别利用CaMV 35S组成型启动子和rd29A逆境诱导型启动子获得了DREB 1A的转基因植株，结果显示rd29A::DREB 1A转基因植株的胁迫耐性明显高于35S::DREB1A的转基因植株，表明rd29A启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐等逆境胁迫的适应性。Brown等(2001)首次在冬麦中发现了受低温诱导的blt101.1基因启动子，并通过渐变缺失鉴定到了一个高度保守的TCA like元件(TCATCTTCTT)，表明该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi等(2003)在小麦种分离到一个低温应答基因Wcor 15上游1.7kb的启动子序列，结果显示该区段内包含有4个CRT/DRE like序列，包括CCG AC核心基序，实验证明该启动子受低温和光诱导。

利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的高效表达，从而改良作物对逆境胁迫的适应性已成为目前的研究热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的逆境相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种逆境诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的逆境诱导型启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因ZmLOX10的逆境诱导型启动子序列和5’非翻译区。

本发明的第三个目的是提供一种检测启动子活性的瞬时表达体系，该体系能反映启动子诱导活性的高低。

为实现上述目的，本发明克隆了玉米脂氧合酶基因(ZmLOX10)的启动子区，并构建了用于转化的植物表达载体，所述载体中包含带有ZmLOX10基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米胚中进行诱导表达，并观察到该启动子与逆境诱导性相关的高水平活性。