[发明专利]一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法

说明书

技术领域

本发明属于红外光谱分析技术领域，具体涉及一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法。

背景技术

蛋白质是一类与生命相关的生物大分子，是生命体最重要的组成部分之一。蛋白质二级结构是指多肽链骨架的局部空间结构, 不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。常见的测定蛋白质二级结构的方法有X射线晶体衍射、核磁共振光谱、圆二色光谱、紫外光谱、荧光光谱与红外光谱法等。

X射线晶体衍射是确定蛋白质构象最准确的方法。虽然其能够提供完整的蛋白质晶体结构信息, 但它要求高质量的单晶样品, 对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说, 得到所需的晶体结构较为困难。核磁共振( NuclearMagnetic Resonance, 简称NMR) 技术可以测定蛋白质在溶液中的构象, 但一般限于研究分子量不超过20 kD 的较小的蛋白, 而且对样品的需求量大、纯度要求高并且整个测定过程较慢, 因而也受到较大的限制。圆二色谱( Circular Dichroism, 简称CD) 法被广泛地用于测定溶液状态下蛋白质和多肽构象的研究, 但是只限于很窄的浓度范围内的澄清的溶液，且误差很大。紫外和荧光光谱只限于测定蛋白质分子中少数含有芳香族和杂环族的共轭环系统的发色团( 如Trp, Try , Phe)。红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopic,简称FT-IR） 属于分子振动吸收光谱, 是化合物鉴定和结构分析的常用手段。其独特之处在于可以测定不同状态、不同环境中的蛋白质和多肽的二级结构。因此它是目前研究蛋白质及多肽结构与功能关系的有效手段之一。然而在水溶液情况下，要得到高质量的红外图谱，一般要求蛋白质的浓度很高（>12mg/ml）。当蛋白质的浓度下降时，红外图谱的质量严重下降，特别是在对蛋白质构象敏感的酰胺I带。随着噪音干扰的强度增加，二阶导数的组成峰发生扭曲，这将直接影响蛋白质二级结构计算的准确度。这一传统方法对于蛋白质浓度的要求使得红外光谱在研究蛋白质二级结构时受到限制，比如对疫苗的研究、对一些难溶性蛋白质的研究等等。更为重要的是，由于荧光光谱和圆二色谱等技术研究蛋白质时要求浓度很低，而传统红外光谱方法要求浓度很高，二者互相比较时就存在很大不确定性。因此建立一种测定低浓度蛋白质二级结构含量的红外光谱方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、测试效率高的用红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法。

本发明提出的红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法，采用蛋白质分析红外光谱仪，具体步骤如下：

1、制备氢氧化铝-蛋白质复合物，具体步骤为：

a. 质量浓度为2% 氢氧化铝胶体和蛋白质对应的缓冲液（如50 mM Tris，PH 7.8，100 mM KCl，1 mM EDTA）按体积比为1:4-1:6混合，以低转速4000-5000rpm（每分钟转数，revolutions per minute）离心2-3分钟； 

b. 去除上清液，用缓冲液（如50 mM Tris，PH 7.8，100 mM KCl，1 mM EDTA）将步骤a中得到的氢氧化铝沉淀重悬至原浓度；

c. 将低浓度（为0.5mg/ml-1.5mg/ml）的蛋白质和步骤b中所得的氢氧化铝胶体按体积1:8-1:12混合，摇匀后放置室温孵化30-40分钟；

d. 将步骤c中所得的混合物以转速4000-5000rpm离心2-3分钟，去除上清液；

2、收集谱图：将由缓冲液洗过的的氢氧化铝胶体均匀的铺满蛋白质分析红外光谱仪的6.5um固定光程的CaF₂样品池，使用Prota数据处理软件收集背景光谱；在相同条件下，将氢氧化铝-蛋白质复合物均匀的铺满CaF₂样品池，调节固定样品池，使得和背景的光程一样，收集样品的红外光谱图；

3、谱图处理：使用Prota数据处理软件，将氢氧化铝-蛋白质复合物的红外图谱扣除氢氧化铝胶体的背景图谱；位于2000 cm^-1-1750 cm^-1间呈一条光滑直线作为背景扣除与否的标志；使用Prota软件中Savitsky-Golay求导功能对蛋白质吸收光谱进行二次求导，获得二级导数谱，并作基线修正。。