[发明专利]有机磷农药生物标志物的检测方法

权利要求书

1.有机磷农药生物标志物的检测方法，其特征是电化学检测方法，测定分两个步骤：

第一步：乙酰胆碱酯酶加合物的复活及吸附：分别取1.0mL浓度为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和15ng/mL的对氧磷抑制的乙酰胆碱酯酶混合液，与等体积的5mM碘解磷定混合反应15mi n，让抑制的乙酰胆碱酯酶完全恢复活性，然后加入50μL氯化乙酰硫代胆碱，氯化乙酰硫代胆碱的最终浓度为3mM，温浴反应5min，使其充分反应，产生硫代胆碱，再加入制备好的250μL浓度为1mg/mL Fe₃O₄/AuNPs磁性纳米粒子，震荡摇匀30min，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤，形成待检测的Fe₃O₄/AuNPs-硫代胆碱纳米复合物；作为对照，未受对氧磷抑制的3nM乙酰胆碱酯酶与同样浓度的氯化乙酰硫代胆碱混合后加入同样的Fe₃O₄/AuNPs磁性纳米粒子；

第二步：线性扫描法测定：取20μL上述自组装好的Fe₃O₄/AuNPs-硫代胆碱悬液滴于工作电极表面，印刷电极下放置一块磁铁，在外加磁场的作用下，Fe₃O₄/AuNPs-硫代胆碱紧附于工作电极表面，再滴加50μL磷酸缓冲溶液，用线性扫描法进行电化学检测，在扫速为50mV/s，电位扫描范围0.2～1.2V条件下电化学进行检测；作为对照，未受对氧磷抑制的3nM乙酰胆碱酯酶与同样浓度的氯代乙酰硫代胆碱混合后反应，用上述同样的方式进行检测，

抑制率和复活率按如下公式计算：

I％＝(i_o-i_t)/i_o×100％

I_r％＝(i_r-i_t)/i_r×100％

R％＝(i_r-i_t)/(i_o-i_t)×100％

其中i_o和i_t分别来自未经过农药抑制和经过农药抑制后的乙酰胆碱酯酶和氯代乙酰硫代胆碱溶液反应的峰电流，i_r为乙酰胆碱酯酶复活后测得的峰电流。

2.权利要求1中所用Fe₃O₄/AuNPs磁性纳米粒子制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

1)将0.01wt％的四氯化金100mL溶液在搅拌的条件下加热煮沸，随后一次性加入1.0wt％柠檬酸三钠溶液2.5mL，待溶液颜色变成酒红色金胶溶液后，使金胶溶液继续搅拌10min，再停止加热使其冷却至室温，保存于4℃冰箱中备用；

2)取10mg羧基化磁性纳米粒子加入到10mL含0.20wt％聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液的20mM Tris/NaCl溶液中，超声振荡30min，磁铁磁分离、蒸馏水洗涤，弃去多余的PDDA，得到洁净的PDDA-Fe₃O₄磁性纳米粒子；再把PDDA-Fe₃O₄和50mL步骤1)制备的金胶溶液进行混合搅拌30min，带负电的金纳米粒子自组装到带正电的PDDA-Fe₃O₄纳米粒子表面，磁铁磁分离，蒸馏水洗涤重悬浮，配成1mg/mLFe₃O₄/AuNPs核壳式磁性纳米粒子。