[发明专利]一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片及细胞共培养方法

说明书

技术领域

 本发明属于将微流控芯片技术应用于生物医学研究领域，具体涉及一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片及细胞共培养方法。

背景技术

细胞生物学研究正在从对单种细胞的观察和研究，发展到对两种甚至多种细胞相互作用的观察和研究。对于复杂的生物学体系，多种细胞同时存在的体系才能更好的模拟真实存在的细胞微环境，从而更全面深入的探索细胞之间的复杂网络以及介导它们之间相互作用的信号通路等，对于研究机体发育、炎症反应、免疫反应，器官的功能以及肿瘤发生机制均有十分重要的意义。细胞共培养是目前研究细胞-细胞之间相互作用比较常用的方法。传统上研究细胞共培养方法一般分为三类：混合共培养、微载体共培养和bodyen小室共培养。混合共培养就是将两种及以上的细胞混合后在孔板内进行共培养，细胞共用培养液，通过分泌到培养液中的细胞因子进行细胞与细胞之间的相互作用，从而影响细胞的形态、增值或者其他行为；微载体共培养即将一种细胞培养在微载体上，另一种细胞培养在培养皿中，随后将徽载体细胞电加^培养皿中．过一定时间即可观察两种细胞相互作用，但这种方法一般应小于4小时，防止细胞从微载体迁移至培养皿中；bodyen小室共培养是一种底部由有机材料的微孔膜制成的培养套皿，因为可溶性物质可以自由通过，培养在套皿中的细胞可通过膜与培养在培养皿中的细胞发生相互作用。以上三种方法均存在试剂消耗量大，细胞用量多，不能方便的实现流体控制等诸多缺点。同时比较难以模拟生物体内复杂的微环境，对于实验结果难以实时追踪，只能获得最终结果，有可能缺失重要的生物学信息。而微流控芯片技术其特有的微尺寸特征与细胞大小正好匹配，通过对芯片功能的要求自行灵活设计，在一定程度上实现集成特征，非常适合进行细胞功能和细胞微环境相互作用的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片及细胞共培养方法，本发明具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点。

本发明提供了一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片，该微流控芯片由灌流通道、入口池、培养小室、废液池和微通道组成；其中：灌流通道包括灌流通道A（1）、灌流通道B（2）；入口池包括样品入口池A（3）、样品入口池B（4）、灌流通道A入口池（5）、灌流通道B入口池（6）；废液池包括灌流通道A废液池（7），灌流通道B废液池（8）；培养小室包括培养小室A（9）和培养小室B（10）；培养小室A和培养小室B左右相连形成一个细胞共培养单元；培养小室的上端与样品入口池相连，下端连接废液池，灌流通道与培养小室通过微通道相连。

本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。

本发明还提供了基于上述微流控芯片的细胞共培养方法，利用该芯片可以产生稳定的浓度梯度，进而进行细胞接触式共培养和/或细胞混合式共培养；具体步骤如下：(1)浓度梯度表征：用移液器取一定量的三维基质胶matrigel，通过样品入口池B和A顺序加入培养小室B和A，将其放入37℃培养箱孵育20-30min，待胶凝后，向灌流通道A和B分别加入含有异硫氰酸荧光素（FITC）标记的荧光染料的培养液和不含有荧光染料的培养液，并保证以0.4μl/min流速持续灌流；(2)细胞接触式共培养：通过样品入口池B将涎腺腺样囊性癌细胞（ACCM）和matrigel的混合物加入培养小室B，放置于CO₂培养箱内；待胶凝20-30min后，通过样品入口池A将间充质干细胞（MSCs）加入培养小室A，放置于CO₂培养箱内；待胶凝20-30min后，灌流通道A和B中加入细胞培养液，细胞培养液每天更换一次；(3)细胞混合式共培养：将涎腺腺样囊性癌细胞（ACCM）和间充质干细胞（MSCs）以10:1的比例混合在matrigel中，通过样品入口池B加入细胞混合物和matrigel，放置于CO₂培养箱内，待胶凝20-30 min后，通过样品入口池A加入不含任何细胞的matrigel，待胶凝20-30 min后，形成胶与细胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分别加入含有细胞趋化因子的培养液和不含有细胞趋化因子的培养液。

本发明提供的细胞共培养方法，所述三维基质胶matrigel为小鼠癌组织中提取的基底膜样物质，低温（0-4℃）时为液态，室温时凝固成胶态；所述细胞趋化因子为基质细胞衍生因子CXCL12；所述浓度梯度表征中，细胞共培养单元横向的浓度梯度用异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐（FIEC-dextran，分子量为10000 Da）分子表征。